Avances en la composición mosaico de imágenes mediante el microscopio de fluorescencia de mesa APEXVIEW™ APX100

Introducción

El microscopio de fluorescencia de mesa APEXVIEW^™ APX100 permite observar muestras celulares y tisulares. Precisamente, en el caso de las muestras tisulares, puede que la estructura completa se exponga a un examen para hallar regiones de interés cuya amplitud sobrepasa la capacidad del campo visual de un microscopio.

Por consiguiente, llevar a cabo una composición mosaico de múltiples imágenes, obtenidas a partir de campos visuales con vistas a obtener una imagen de área superior y de alta resolución, es una función esencial cuando se observan muestras tisulares. A continuación, se explican tres puntos esenciales para la composición mosaico de imágenes:

1. Precisión de la unión

La imagen de composición mosaico se forma a medida que la platina XY motorizada se desplaza en función de cada campo visual.

No obstante, es posible que se produzca una falta de alineación a nivel de la platina XY. Si con ello la posición de la unión se encuentra únicamente determinada por las coordenadas XY de cada campo visual, la imagen de composición mosaico expondrá cambios en dichos campos tras la unión. Por tanto, el procesamiento de imágenes sirve para determinar la posición de la unión a través de una búsqueda en cada imagen. Es sumamente importante evitar cualquier desviación durante la composición mosaico, dado que ello puede tener efectos negativos en los análisis de imágenes subsecuentes.

2. Calidad de la imagen de composición mosaico

En la periferia del campo visual, los factores ópticos pueden afectar de varias formas la calidad de imagen. Es primordial evitar la degradación de la calidad de imagen cuando se procesa una imagen de composición mosaico.

3. Capacidad de procesamiento

Las imágenes destinadas a la composición mosaico requieren exactitud y calidad de imagen; por consiguiente, se tiene que dedicar tiempo a su captura a partir de cada campo visual con el fin de formar una óptima imagen de composición mosaico. También, se requiere tiempo al procesar dichas imágenes tras su adquisición, lo que coarta el avance del flujo experimental. En la adquisición de las imágenes destinadas a la composición mosaico, se requiere calidad y una capacidad de procesamiento que permita obtener datos experimentales de forma eficiente.

Desarrollo a nivel de la imagen de composición mosaico con el microscopio APX100

La captura de imágenes destinadas a una imagen de composición mosaico es una de las aplicaciones clave del microscopio APX100.

Por ello, hemos mejorado la calidad de estas imágenes a través de una actualización de software. Al mismo tiempo, hemos incrementado la eficiencia experimental que ofrece el microscopio APX100.

El software cellSens™ APEX, que es el  software de control del microscopio APX100, ofrece tres avances clave dentro de la función de composición mosaico a través de su versión 4.3.1.

1. Precisión mejorada de la composición mosaico

Optimización del algoritmo de composición mosaico

La composición mosaico de imágenes adyacentes en el campo visual se ejecuta a través de un procesamiento de imágenes. Con la versión anterior del  software, las imágenes aún se unían inmediatamente tras pasar cada campo visual: un método conocido como composición mosaico secuencial o unión secuencial.

Mediante el método de composición mosaico secuencial, el área unida proporciona sólo una pequeña cantidad de información cuando la parte de unión de las imágenes, provenientes de los campos visuales adyacentes, ocupa sólo un área de fondo sin muestra. Esto conlleva a una falta de alineación en la composición mosaico.

Con la versión 4.3.1 del software cellSens APEX, la alineación ha sido mejorada. El algoritmo de composición mosaico ahora retiene las imágenes de un cierto rango de campos visuales hasta obtener una óptima posición; tras ello, busca dicha óptima posición dentro del rango retenido (Figura 1).

Con el método de composición mosaico secuencial, sólo los cuadros que están en posición pueden ser usados para la alineación. En el caso del método de composición mosaico actual, que retiene una imagen de cierto rango de campos visuales, el cuadro para alinear puede fijarse en función del cuadro ya en posición y del cuadro dentro del rango retenido.

Mediante la actualización de este método, el algoritmo que viene en la versión 4.3.1 del  software ahora permite adquirir sin desviaciones imágenes destinadas a la composición mosaico, incluso en el caso de áreas de unión que incluyen el fondo de imagen (Figura 2).

La cantidad de tiempo para obtener imágenes destinadas a la composición mosaico no varía con la versión 4.3.1.

Corrección del fenómeno óptico que afecta la exactitud de la composición mosaico

Un error de magnificación forma parte de los factores ópticos que pueden afectar la exactitud de la composición mosaico. El software cellSens APEX posee una función para compensar este fenómeno óptico.

Función para la corrección de magnificación

Las lentes de objetivo poseen un ínfimo error de magnificación; por consiguiente, corregir dicho error posibilita una composición mosaico exacta.

Con el microscopio APX100, la magnificación total de todo el microscopio, como en la lente de objetivo, puede ser corregida al usar la función de corrección de magnificación que viene siendo suministrada desde la versión 4.2 del  software cellSens APEX. Esto permite generar imágenes de exactitud muy elevadas destinadas a la composición mosaico.

Dado que el proceso de corrección de magnificación se ejecuta en directo, cada vez que una imagen es capturada, el tiempo de adquisición no cambia con o sin la corrección activada.

2. Calidad de imagen optimizada para la composición mosaico

La distorsión también forma parte de los factores ópticos que pueden afectar la calidad de la imagen de composición mosaico. El software cellSens APEX posee una función para compensar este fenómeno.

Función para la corrección de distorsión

Durante la formación de las imágenes a través de la lente de objetivo en un sistema microscópico, ocurre un fenómeno en el campo visual denominado distorsión (Figura 4).

Si la imagen de composición mosaico se forma cuando hay distorsión en el campo visual, las estructuras se duplicarán en las cuatro esquinas de la posición de unión. Esta doble apariencia de las estructuras, a nivel de las esquinas, incrementa la posibilidad de degradación en la imagen.

Por consiguiente, para evitar distorsión y obtener una imagen de composición mosaico dotada de una alta calidad, un método apropiado es el de usar sólo el centro de las imágenes. Sin embargo, este método incrementa la cantidad de imágenes requeridas en la adquisición y reduce la capacidad de procesamiento (Figura 5).

En la versión 4.3.1 del  software cellSens APEX, se ha agregado una función para compensar esta distorsión (Figure 6). Con esta función, se mide la cantidad de distorsión por cada lente de objetivo gracias a un portaobjetos de calibración. Tras ello, cuando se adquiere una imagen destinada a la composición mosaico, se corrige la distorsión en función de la cantidad de distorsión medida a partir de cada imagen de un campo visual.

3. Optimización de la distribución del trabajo

El microscopio APX100 ejecuta automáticamente todo el proceso —desde la adquisición de imágenes hasta su composición mosaico— a través de una serie de flujos de trabajo; esto favorece una adquisición eficiente de las imágenes destinadas a la composición mosaico.

También presenta un navegador de muestra inteligente que agiliza el flujo de trabajo experimental. El navegador de muestra inteligente puede detectar automáticamente y en sólo 10 segundos muestras a partir de la captura de macroimágenes. La función dedicada a convertir el área de muestra a un área de escaneo (Convert Sample Area to Scan Area), que integra el software cellSens APEX desde la versión 4.2, permite al usuario determinar el área de la muestra detectada como área de adquisición para la composición mosaico (Figura 7).

Esto agiliza exponencialmente la distribución del trabajo, desde la preparación de la observación preliminar, la configuración de la posición de unión, hasta la adquisición de las imágenes.

Conclusión

El microscopio de fluorescencia de mesa APEXVIEW APX100 ahora ofrece imágenes destinadas a la composición mosaico, que se dotan de una calidad y exactitud ampliamente optimizadas, además de una eficiencia experimental pormenorizada para la configuración de adquisición de las imágenes. Aparte de haber mejorado el algoritmo de composición mosaico del software, nuestros ingenieros han puesto en valor la corrección de factores ópticos con el fin de alcanzar un mejor rendimiento.

En resumen, los avances aplicados a la imagen de composición mosaico, comprenden:

• precisión mejorada en el área de unión, que cubre también el cuadro de fondo;
• exactitud intensificada para corregir el error de magnificación;
• calidad de imagen superior para corregir la distorsión, y
• distribución del trabajo pormenorizado para adquirir imágenes destinadas a la composición mosaico con alta resolución y de área superior.

Autor

Takuma Kimura

I+D, Desarrollo de software, Evident