La microscopie en fond noir est une technique d'éclairage utilisée pour améliorer le contraste d'échantillons transparents non colorés. Grâce à un éclairage oblique, la lumière directe est bloquée, de sorte que seule la lumière diffusée, diffractée ou réfractée pénètre dans l’objectif du microscope. Il en résulte un spécimen fortement éclairé, superposé à un fond sombre.
Ce degré élevé de contraste permet de faire ressortir les échantillons avec des fonds difficiles avec relativement peu d'efforts, ce qui en fait un outil précieux pour observer des spécimens qui ne sont pas bien imagés dans des conditions d'éclairage normales.
Comment fonctionne la microscopie en fond noir ?
La microscopie en fond noir fonctionne en bloquant la lumière centrale et en dirigeant un éclairage oblique sur l'échantillon. Comme la lumière directe est bloquée par un diaphragme opaque situé dans le condenseur, seule la lumière diffusée, diffractée ou réfractée pénètre dans l'objectif, ce qui permet d'obtenir une image claire du spécimen en fond sombre.
Voici un aperçu plus détaillé du processus :
- Lumière centrale bloquée : Un cache opaque bloque la lumière qui, en temps normal, traverse directement l'échantillon et l'entoure.
- illumination oblique : La lentille supérieure d’un condenseur Abbe pour fond noir simple est concave de façon sphérique. Cela permet aux rayons lumineux provenant de la surface de former un cône de lumière creux inversé focalisé sur le plan de l'échantillon.
- La lumière diffusée pénètre dans l'objectif : Lorsqu'un échantillon est placé sur la lame, les rayons obliques interagissent avec lui. Les éléments de l'échantillon (comme les membranes cellulaires ou les organites internes) diffractent, réfléchissent et réfractent la lumière vers l'objectif.
- Fond noir : Dans les zones sans échantillon, les rayons obliques se croisent et manquent complètement l'objectif, laissant ces zones complètement sombres.
À quoi sert la microscopie en fond noir ?
La microscopie en fond noir est principalement utilisée pour observer des spécimens transparents ou non colorés qui ne présentent pas un contraste suffisant en imagerie en fond clair. Elle est très efficace pour révéler les contours, les bords, les limites et les gradients d'indice de réfraction.
Les applications courantes comprennent :
- Échantillons biologiques : Organismes aquatiques vivants, bactéries, levures, protozoaires et cellules en culture tissulaire.
- Détails structurels : Bords, limites et caractéristiques de surface comme les cheveux et les fibres.
- Spécimens non biologiques : Cristaux minéraux et chimiques, particules colloïdales, échantillons pour le comptage des poussières et lames minces de polymères et de céramiques contenant de petites inclusions ou des différences de porosité.
Exemples d'images en fond noir
En général, les objets imagés dans des conditions appropriées d’éclairage en fond noir sont spectaculaires à voir. Voici quelques exemples saisissants de spécimens capturés grâce à l'imagerie en fond noir :
Squames d'aile de papillon
Image en fond noir montrant les squames miniatures qui ornent la majeure partie de la surface d'une aile de papillon. Les squames de l’aile ont été illuminées à l’aide d’un condenseur en fond noir sous la platine et photographiées à faible grossissement (50X).
Diatomées
Image en fond noir de la diatomée Arachnoidiscus ehrenbergi obtenue avec un microscope Evident par Mortimer Abramowitz. L'échantillon a été observé à l'aide d'un condenseur à champ sombre à haute NA, avec de l'huile d'immersion placée entre la lame de microscope et les lentilles frontales de l'objectif et du condenseur.
ADN en phase cristalline liquide
Image en fond noir d'ADN en phase cristalline liquide. Cette solution d'ADN hautement concentrée a subi une série de transitions de phase cristalline liquide pour former une phase hexagonale densément compactée. Image prise à l'aide d'un microscope optique à lentilles composées équipé d'un objectif 10X.
Alliage aluminium-silicium
Image en fond noir d’un alliage aluminium-silicium poli prise avec le microscope métallurgique GX53
Microscopie en fond noir vs. microscopie en fond clair
Comprendre les différences entre la microscopie en fond sombre et la microscopie en fond clair peut vous aider à choisir la technique la mieux adaptée à votre échantillon. Voici un guide comparatif rapide :
Avantages et inconvénients de la microscopie en fond noir
Bien que l'éclairage en fond noir produise des images spectaculaires, il est important d'en peser les avantages et les inconvénients.
Avantages
- Contraste élevé : Offre un contraste élevé, facilitant la visualisation des échantillons sur des fonds difficiles.
- Idéal pour les échantillons transparents à faible contraste : Parfait pour les spécimens presque invisibles en fond clair.
- Coloration minimale : Permet l'observation des spécimens sans avoir recours à des procédures de coloration complexes.
- Utile en ce qui concerne les spécimens vivants : Comme aucune coloration n'est nécessaire, les organismes et cellules aquatiques vivants peuvent être observés dans leur état naturel.
- Images visuellement saisissantes : Produit des images qui ressemblent souvent à des œuvres d'art.
Inconvénients
- Détails internes limités : Moins utile pour révéler les détails internes d'un spécimen.
- Sensible aux débris et à la contamination : Chaque particule de poussière ou débris présente sur la lame sera illuminée, ce qui peut dégrader l'image.
- Nécessite un alignement : Le condenseur doit être parfaitement aligné et mis au point pour éviter un éclairage irrégulier ou des zones sombres au centre du champ de vision.
- Peut être peu lumineux : Nécessite une quantité importante de lumière, car une grande partie est bloquée afin de former le cône d'illumination.
- Limites des objectifs : Tous les objectifs ne sont pas adaptés, surtout si l’on utilise des inserts de condenseur qui n’offrent pas une ouverture numérique (O.N.) suffisamment élevée.
La microscopie en fond noir nécessite-t-elle une coloration ?
Non, la microscopie en fond noir ne nécessite souvent pas de coloration. Elle est particulièrement utile pour observer des spécimens transparents, non colorés ou à faible contraste qui sont difficiles à voir dans des conditions normales d'observation en fond clair. En effet, éviter la coloration permet aux chercheurs d'observer des spécimens vivants, tels que des organismes aquatiques et des cultures cellulaires, sans altérer leur état naturel. Cependant, les spécimens teintés (comme les sections de tilleul) peuvent également être d'excellents candidats, produisant de belles images colorées.
Image en fond noir d'une section mince colorée de tilleul d'Amérique (Tilia americana).
Quel équipement est nécessaire pour la microscopie en fond noir ?
Presque tous les microscopes de laboratoire à champ clair peuvent être facilement convertis pour effectuer une illumination en fond noir. L'équipement essentiel comprend :
- Compatibilité avec les microscopes en fond clair : Un microscope de laboratoire standard pouvant accepter des composants en fond noir.
- Condenseur en fond noir ou diaphragme/insert : Un condenseur en fond noir dédié offre l'ouverture numérique élevée requise. Alternativement, des inserts de condenseur peuvent créer le cône d'illumination nécessaire, offrant une flexibilité pour de multiples méthodes d'observation.
- Compatibilité des objectifs : Les objectifs doivent correspondre aux capacités d'ouverture numérique de votre système de condenseur.
- source d'éclairage : Une source lumineuse puissante est nécessaire pour compenser le blocage de la lumière centrale.
- Outils d'alignement du condenseur : Nécessaires pour centrer le condenseur afin d'assurer un éclairage uniforme.
- Lames et optiques propres : Des lames propres sont essentielles, car la moindre impureté diffusera la lumière et réduira la qualité de l'image.
Comment configurer la microscopie en fond noir
La configuration du microscope pour l’imagerie en fond noir est un processus simple. Suivez ces étapes pour des résultats optimaux :
- Installer un condenseur en fond noir ou un diaphragme en fond noir : Remplacez votre condenseur actuel par un condenseur en fond noir dédié, ou insérez un diaphragme en fond noir dans votre condenseur compatible existant.
- Placer et préparer l'échantillon : Assurez-vous que votre lame et votre lamelle sont propres, puis placez votre échantillon sur la platine.
- Aligner et effectuer la mise au point du condenseur : Centrer et effectuer la mise au point du condenseur correctement. Si vous voyez une tache sombre au centre de votre champ de vision, il est probable que le condenseur soit mal aligné.
- Utilisez un objectif compatible : Choisissez un objectif avec une ouverture numérique appropriée pour votre condenseur en fond noir.
- Augmentez l'éclairage : Augmentez la puissance de votre source lumineuse. La microscopie en fond noir nécessite plus de lumière que la microscopie en fond clair, car les rayons centraux sont bloqués. Remarque : Faites attention aux échantillons vivants qui peuvent être sensibles à une exposition prolongée à une lumière intense.
Pour obtenir des conseils d'experts sur la mise en place d'un microscope adapté à la microscopie en fond noir pour votre application d'imagerie spécifique, contactez l'équipe Evident dès aujourd'hui.
Alec De Grand
Chef de produit
Alec De Grand est chef de produit chez Evident pour la numérisation de lames virtuelles et les microscopes verticaux destinés aux sciences de la vie. Il est chez Evident depuis plus de 10 ans, au cours desquels il a géré des produits cliniques, des initiatives marketing, des formations en imagerie et des salons professionnels.