Foire aux questions sur les objectifs de microscope
Qu’est-ce que l’ouverture numérique (ON), et pourquoi est-elle importante dans les objectifs de microscope ?
L’ouverture numérique est la mesure de la capacité d’un objectif à absorber la lumière et à distinguer les petits détails. Une grande ON signifie que la lentille d’objectif peut capter davantage de lumière provenant de l’échantillon et discerne mieux les particularités, ce qui permet d’obtenir des images plus claires en plus haute résolution. Dans la pratique, les objectifs à grande ON permettent d’observer avec plus de précision les détails structurels que les lentilles d’objectif à petite ON.
Que sont les aberrations chromatiques, et comment les objectifs apochromatiques peuvent-ils les corriger ?
Une aberration chromatique est une erreur de mise au point qui survient quand différentes longueurs d’ondes lumineuses ne convergent pas vers le même point, ce qui produit une frange colorée sur l’image. Les objectifs achromatiques standards sont capables de corriger cela pour deux couleurs (en général le rouge et le bleu), mais un léger flou chromatique peut subsister. Les objectifs apochromatiques sont conçus pour mettre les trois couleurs (rouge, vert, bleu) au même point, éliminant presque entièrement les aberrations chromatiques pour obtenir une image nette et fidèle aux couleurs. Les lentilles d’objectif plan apochromatique d’Olympus exploitent ce haut degré de correction pour produire des images sans aucun halo coloré, et ce, même lors d’expériences de fluorescence multicolore.
Quelle est la différence entre les objectifs achromatiques, les objectifs fluorites (semi-apochromatiques), et les objectifs apochromatiques ?
Ces termes font référence au niveau de correction optique des lentilles d’objectif.
- Les objectifs achromatiques sont les plus courants et corrigent les aberrations chromatiques sur deux longueurs d’ondes (en général le rouge et le bleu) ainsi que les aberrations sphériques pour une couleur.
- Les objectifs fluorites (semi-apochromatiques) utilisent un verre spécial (fluorite) pour obtenir une meilleure correction, permettant généralement de faire la mise au point sur davantage de couleurs et d’améliorer la correction des aberrations sphériques, ce qui se traduit par un meilleur contraste et une ON souvent plus grande que celle des objectifs achromatiques.
- Les objectifs apochromatiques offrent la correction la plus élevée, car ils sont capables de faire la mise au point sur trois longueurs d’ondes ou plus et corrigent les aberrations sphériques sur plusieurs couleurs. Ils offrent une excellente qualité d’image et possèdent généralement les plus grandes ouvertures numériques.
En résumé, les objectifs achromatiques sont économiques et adaptés à une utilisation quotidienne, les objectifs fluorites offrent un bon compromis entre performance et coût, tandis que les objectifs apochromatiques garantissent la meilleure résolution et une excellente fidélité des couleurs pour les applications les plus exigeantes.
Que signifie « plan » dans les noms d’objectifs (tels que plan achromatique ou plan apochromatique) ?
Le « plan » désigne un objectif à champ plat, ce qui veut dire qu’il est corrigé pour produire une image nette et plane sur l’ensemble du champ d’observation. Sans cette correction, la périphérie de l’image serait floue lorsque le centre est net. Les objectifs plan éliminent la courbure de champ, ce qui rend également nets les bords du champ d’observation. Par exemple, les objectifs de la série Olympus MPLN (plan achromatique) sont conçus pour fournir une planéité optimale sur l’ensemble du champ, assurant une clarté uniforme. Ceci est particulièrement important pour l’imagerie numérique ou les oculaires grand champ, là où une lentille d’objectif non plan rendrait les bords flous.
Que sont les objectifs Olympus MPLAPON et MPLAPON-Oil, et quand les utiliser ?
La série Olympus MPLAPON offre des objectifs plan apochromatiques haut de gamme conçus pour une utilisation à l’air libre. Ces objectifs à sec sont reconnus pour leur excellente correction des couleurs et leur haute résolution. Ils corrigent les aberrations chromatiques dans un large éventail d’applications et offrent une très haute fidélité d’image, ce qui les rend parfaitement adaptés à l’observation d’échantillons en fond clair, en fluorescence ou en CID.
MPLAPON-Oil est la version en immersion dans l’huile de cette série. Elle utilise la même optique apochromatique avancée, mais emploie de l’huile d’immersion pour atteindre une ouverture numérique encore plus élevée (ON jusqu’à 1,45), offrant ainsi une résolution améliorée.
Utilisez une lentille d’objectif à sec MPLAPON quand vous avez besoin d’un faible grossissement et qu’il vaut mieux éviter d’utiliser de l’huile d’immersion. Optez pour une lentille d’objectif MPLAPON-Oil quand une plus haute résolution et une luminosité améliorée (généralement un grossissement de 60x à 100x) sont nécessaires et que votre échantillon peut être utilisé avec de l’huile d’immersion.
Pourquoi l’utilisation d’une huile d’immersion permet-elle d’obtenir une meilleure résolution qu’un objectif à sec ?
L’huile d’immersion dispose d’un meilleur indice de réfraction (environ 1,51) que l’air (1,0), ce qui permet à l’objectif de capter la lumière à plus grand angle. Avec l’air comme milieu, la valeur maximale théorique de l’ON est de 1,0 (car sin 90° = 1 et n = 1,0). Dans la pratique, la plupart des objectifs à sec haut de gamme atteignent une ON maximale de 0,95. En utilisant de l’huile entre la lamelle et la lentille, l’indice de réfraction augmente à environ 1,51, pour une ON atteignant environ 1,3 à 1,4. Cette ON plus élevée améliore considérablement la résolution, car la lentille capte davantage de lumière diffractée provenant des petits détails. En résumé, l’immersion dans l’huile permet de distinguer des détails plus précis (et de produire des images plus lumineuses) que les lentilles d’objectif à sec avec le même grossissement.
Peut-on utiliser un objectif à immersion dans l’huile sans huile ?
Non, utiliser un objectif à immersion dans l’huile sans le milieu spécifié nuit aux performances. Les objectifs à immersion dans l’huile sont conçus pour que l’huile (n ≈ 1,51) comble l’espace entre la lamelle et la lentille. Si vous utilisez de l’air (avec l’air, n = 1,0) ou de l’eau avec un objectif conçu pour de l’huile, les composants optiques souffriront d’aberrations sphériques et d’une perte de résolution, car les rayons lumineux ne se focaliseront pas correctement. Les fabricants déconseillent vivement d’utiliser des objectifs à immersion dans l’huile avec de l’eau ou d’autres milieux incompatibles. Utilisez toujours le milieu prévu (huile, eau ou glycérine, comme indiqué sur l’objectif). Dans le cas contraire, l’image risquera d’être floue et ne fournira pas la puissance de résolution annoncée de l’objectif.
Qu’est-ce qu’une bague de correction sur un objectif de microscope, et quand l’utiliser ?
Une bague de correction est un anneau ajustable sur certains objectifs de pointe qui compense l’épaisseur de la lamelle couvre-objet ou les différences de milieux d’immersion. De nombreux objectifs sont conçus pour une épaisseur standard de lamelle de 0,17 mm (lamelle couvre-objet # 1,5). Si votre lamelle est plus épaisse ou moins épaisse que cela, ou si vous effectuez une imagerie dans un fluide ayant un indice de réfraction différent, vous risquez d’obtenir une aberration sphérique ou une image floue.
Les objectifs avec bague de correction vous permettent de régler la lentille en fonction de ces variations, la bague ajuste mécaniquement les groupes de lentilles internes pour optimiser la mise au point. En ajustant la bague de correction pour correspondre précisément à l’épaisseur de votre lamelle, vous préviendrez les images floues et les aberrations causées par une épaisseur de lamelle non standard. Dans la pratique, il vous suffit de tourner la bague jusqu’à ce que l’image (surtout en cas de grande profondeur de champ) devienne la plus nette possible. Utilisez la bague de correction lorsque votre lamelle ou échantillon diffère de l’épaisseur standard (0,17 mm), comme avec les chambres pour cellules vivantes au fond plus épais, pour obtenir la meilleure qualité d’image possible.
Pourquoi est-ce si important d’avoir une épaisseur de lamelle couvre-objet de 0,17 mm pour les objectifs ?
Les objectifs puissants sont calibrés pour les lamelles de 0,17 mm (l’épaisseur standard d’une lamelle couvre-objet # 1,5). Si vous utilisez un verre bien plus épais ou plus fin entre l’objectif et l’échantillon, les rayons lumineux ne convergeront pas comme prévu, ce qui créera des aberrations sphériques et même chromatiques. Cela se traduit par des images floues ou déformées. De nombreux objectifs avancés comprennent une bague de correction pour compenser ces aberrations. Pour les objectifs sans bague, il est crucial de respecter l’épaisseur de lamelle recommandée. L’épaisseur standard de lamelle couvre-objet de 0,17 mm permet de s’assurer que la conception des composants optiques de l’objectif fonctionne de manière optimale, offrant une image nette et une mise au point correcte sur l’ensemble du champ.
Les objectifs Evident/Olympus sont-ils compatibles avec les microscopes d’autres marques ?
La compatibilité n’est pas garantie, surtout en ce qui concerne les systèmes modernes corrigés à l’infini. Les objectifs de microscope utilisent souvent des filetages standardisés (par exemple, le filetage RMS est couramment utilisé sur de nombreux objectifs Olympus), il est donc possible de réussir à visser un objectif Olympus sur la tourelle porte-objectifs d’une autre marque. Cependant, la conception des composants optiques peut être différente : les objectifs corrigés à l’infini doivent être utilisés avec la lentille de tube, la longueur focale et les corrections adaptées. Par exemple, les objectifs Olympus corrigés à l’infini sont conçus pour une lentille de tube de 180 mm, tandis que d’autres marques peuvent utiliser une lentille de tube de 200 mm. Les mélanger risque de changer le grossissement obtenu et d’introduire des aberrations. De plus, tous les fabricants n’utilisent pas le même filetage ou la même distance parfocale pour les objectifs de pointe. En résumé, il est recommandé d’utiliser les objectifs Evident ou Olympus avec des microscopes Evident/Olympus (ou les microscopes conçus spécifiquement pour eux) pour obtenir la performance indiquée. Vérifiez toujours le type de filetage, la longueur de tube, et la compatibilité avant de mélanger les objectifs de différents fabricants.
Quels facteurs prendre en compte lors du choix d’un objectif pour microscopie confocale ?
La microscopie confocale requiert une haute résolution et une captation efficace de la lumière : les premiers facteurs seront donc une grande ON et une excellente correction optique. Choisissez un objectif avec une grande ON (p. ex., 60x / 1,40 huile ou 60x / 1,20 eau) pour recueillir un maximum de signal de fluorescence et de détails. En microscopie confocale et dans d’autres techniques à fort grossissement, nous repoussons les limites de l’ON pour atteindre une résolution améliorée. Les objectifs plan apochromatiques sont plus adaptés à la microscopie confocale, car ils offrent une correction chromatique supérieure (ce qui est important lors de l’imagerie de plusieurs canaux de fluorescence) et un champ d’observation plat. Les objectifs de notre série Olympus X Line™, par exemple, combinent une ON, une planéité et une correction des aberrations chromatiques améliorées entre 400 et 1 000 nm, ce qui les rend parfaitement adaptés à l’imagerie confocale multicolore. Prenez également en compte la distance frontale et le milieu d’immersion. Pour les échantillons épais et les cellules vivantes, une lentille d’objectif à immersion dans l’eau ou le silicone peut aider à réduire les différences d’indices de réfraction. Pour les échantillons fixés sur les lames, les lentilles d’objectif à immersion dans l’huile fournissent une plus grande ON et une plus haute résolution.
Faut-il utiliser des objectifs spécifiques pour la microscopie à contraste interférentiel différencié (CID) ?
Le CID utilise la lumière polarisée et les prismes de Nomarski/Wollaston pour créer du contraste. Par conséquent, les objectifs destinés à la microscopie à CID doivent être largement exempts de contraintes (sans biréfringence interne), afin de ne pas perturber la lumière polarisée. Contrairement aux objectifs en contraste de phase, les objectifs CID ne possèdent généralement ni anneaux intégrés ni modifications particulières : le plus important est une très bonne qualité optique et peu de contraintes dans le verre. Nos objectifs plan (p. ex., Olympus UPlan ou la série MPLN) sont fabriqués pour êtres compatibles avec le CID. Beaucoup sont étiquetés comme compatibles CID, ou offrent de bonnes performances simplement en raison de leur faible contrainte interne. Auparavant, des versions « POL » ou sans contraintes étaient vendues spécifiquement pour la microscopie en polarisation, mais de nombreux objectifs Olympus apochromatiques et fluorites présentent un niveau de contrainte suffisamment faible pour être utilisés en CID. Vous n’avez donc pas besoin d’un objectif spécifiquement dédié au CID, puisque vous pouvez utiliser un objectif plan achromatique/fluorite/apochromatique de haute qualité connu pour fonctionner avec le CID (et assurez-vous d’utiliser la glissière à prisme de CID adaptée pour le grossissement de votre objectif).
Quels objectifs sont recommandés pour l’imagerie de cellules vivantes (comme la microscopie de longue durée sur des cellules ou tissus vivants) ?
L’imagerie de cellules vivantes bénéficie souvent d’objectifs à immersion spécialisés, en particulier à immersion dans l’eau ou le silicone. Les milieux d’immersion de ces objectifs disposent d’indices de réfraction plus proches de celui des cellules vivantes (environ 1,33 pour l’eau et 1,40 pour le silicone) afin de minimiser les aberrations sphériques lors de l’imagerie au sein d’échantillons aqueux.
Nos objectifs à immersion dans le silicone sont parfaitement adaptés au travail sur cellules vivantes. Les objectifs à immersion dans le silicone (p. ex., Olympus UPLSAPO 60XS silicone) ont une grande ON (environ 1,30) et une distance frontale relativement grande (environ 0,3 mm) pour pouvoir observer l’intérieur d’échantillons épais. Le principal avantage de l’huile de silicone est qu’elle ne s’évapore ni ne sèche à 37 °C (98,6 °F), ce qui rend l’imagerie de longue durée plus stable et nécessite moins d’entretien que l’immersion dans l’eau. Les objectifs à immersion dans l’eau (ON d’environ 1,1 ou 1,2) sont également utilisés pour les cellules vivantes, en particulier pour l’imagerie de courte durée, puisqu’ils correspondent naturellement au milieu des cellules. Cependant, l’eau peut s’évaporer ou dérégler la mise au point au fil du temps.
Pour les longues expériences sur cellules vivantes, les objectifs à immersion dans le silicone constituent souvent le meilleur choix, car ils fournissent une haute résolution et une forte luminosité dans des conditions biologiques naturelles, sans les inconvénients du dessèchement et de l’aberration sphérique. En règle générale, assurez-vous toujours que l’objectif sélectionné soit compatible avec votre microscope et que vous disposez de l’huile d’immersion adaptée ou d’un système d’approvisionnement en eau conçu pour une utilisation à long terme.