Miglioramento della funzionalità di unione delle immagini nel microscopio a fluorescenza da banco APEXVIEW™ APX100

Introduzione

Il microscopio a fluorescenza da banco APEXVIEW^™ APX100 è utilizzato per l'osservazione di campioni di cellule e tessuti. In particolare per i campioni di tessuto, si potrebbe voler osservare la struttura generale del campione relativamente ad aree di interesse di estensione maggiore rispetto al campo visivo del microscopio.

L'unione di diverse immagini del campo visivo (stitching) per ottenere un'immagine ad alta risoluzione di un'ampia area, rappresenta una funzionalità importante per l'osservazione di campioni di tessuto. Relativamente alla funzionalità di unione delle immagini è fondamentale tenere in considerazione i seguenti tre punti:

1. Precisione dell'unione di immagini

L'immagine unita viene realizzata muovendo il tavolino XY motorizzato per ogni campo visivo.

Tuttavia, visto che si verificano alcuni disallineamenti nel tavolino XY, se la posizione di unione viene determinata solamente attraverso le coordinate XY di ogni campo visivo, l'immagine unita subirà uno spostamento per ogni campo visivo, nel momento in cui viene effettuata l'unione. Pertanto viene applicata l'elaborazione dell'immagine per determinare la posizione di unione, effettuando una ricerca nell'immagine. Durante l'unione delle immagini è necessario evitare qualsiasi deviazione, in modo che non venga influenzata l'analisi dell'immagine.

2. Qualità delle immagini unite

Nella parte esterna del campo visivo, i fattori dell'ottica condizionano la qualità dell'immagine in diversi modi. Quando si elabora un'immagine unita è necessario evitare la degradazione della qualità dell'immagine.

3. Tempi di esecuzione

L'unione delle immagini richiede precisione e qualità delle immagini, pertanto è necessario tempo per acquisire le immagini di ogni campo visivo necessarie per creare un'immagine unita. Dopo l'acquisizione delle immagini, l'elaborazione delle immagini unite richiede anche un maggior lasso di tempo, limitando il flusso di lavoro sperimentale. Per l'ottenimento di dati sperimentali in modo efficiente, l'acquisizione di immagini unite richiede sia una qualità delle immagini che lunghi tempi di esecuzione.

Miglioramenti dell'unione delle immagini del microscopio APX100

L'acquisizione di immagini unite rappresenta una delle applicazioni fondamentali del microscopio APX100.

Per questo motivo abbiamo migliorato la qualità delle immagini unite attraverso l'aggiornamento del software. Allo stesso tempo abbiamo consentito un ulteriore miglioramento dell'efficienza sperimentale attraverso il microscopio APX100.

Il software cellSens™ APEX, il quale rappresenta il software di controllo del microscopio APX100, nella versione 4.3.1 offre tre miglioramenti fondamentali per la funzione di unione di immagini.

1. Miglioramento della precisione di unione

Miglioramento dell'algoritmo di unione

L'unione di immagini adiacenti nel campo visivo viene realizzata mediante l'elaborazione delle immagini. Fino alla versione precedente, le immagini erano unite immediatamente dopo l'acquisizione di ogni singolo campo visivo. Un metodo noto come unione sequenziale (sequential stitching).

Nel metodo di unione sequenziale, l'area unita contiene solo una ridotta quantità di informazioni quando la parte unita delle immagini dei campi visivi adiacenti rappresenta solo un'area di sfondo senza un campione. Questo causa un disallineamento nell'unione.

Nella versione 4.3.1 del software cellSens APEX abbiamo migliorato l'allineamento. Adesso l'algoritmo di unione conserva le immagini di una certa area di campi visivi fino a quando viene raggiunto il posizionamento ottimale. In seguito individua il posizionamento ottimale nell'area delle immagini conservate (Figura 1).

Nel metodo di unione sequenziale, per l'allineamento possono essere usati solo i frame che sono già stati posizionati. Nel metodo di unione che acquisisce un'immagine in una certa area di campi visivi, il frame da allineare può essere posizionato tra il frame già posizionato e il frame nell'area di immagini conservate.

Con il metodo aggiornato, l'algoritmo introdotto nella versione 4.3.1 del software adesso permette l'acquisizione di un'immagine unita senza deviazione, anche nell'area unita che include lo sfondo (Figura 2).

I tempi di ottenimento delle immagini unite rimangono gli stessi nella versione 4.3.1.

Correzione dei fenomeni ottici che influenzano la precisione di unione delle immagini

I fattori ottici come l'errore di ingrandimento possono influenzare la precisione di unione. Il software cellSens APEX integra una funzionalità di compensazione di questo fenomeno ottico.

Funzione di correzione dell'ingrandimento

Gli obiettivi producono un leggero errore di ingrandimento, pertanto la correzione di questo errore permette un'unione di immagini più precisa.

Con il microscopio APX100, l'ingrandimento totale dell'intero microscopio, compresi gli obiettivi, può essere corretto utilizzando la funzione di correzione di ingrandimento integrata nel software cellSens APEX nella versione 4.2. Questo permette la generazione di immagini unite precise (Figura 3).

Visto che il processo di correzione dell'ingrandimento viene eseguito in tempo reale ogni volta che viene acquisita un'immagine, i tempi di acquisizione rimangono invariati con o senza applicazione della correzione.

2. Miglioramento della qualità delle immagini dell'unione di immagini

I fattori ottici come la distorsione possono influenzare la qualità delle immagini dell'unione. Il software cellSens APEX integra una funzione di compensazione di questo fenomeno.

Funzione di correzione della distorsione

Quando delle immagini vengono acquisite attraverso un obiettivo di un microscopio, si verifica un fenomeno di distorsione nel campo visivo (Figura 4).

Se viene eseguita l'unione delle immagini mentre è presente una distorsione nel campo visivo, le strutture appariranno duplicate nei quattro angoli della posizione di unione. Questa duplicazione visiva di strutture negli angoli incrementa la possibilità che venga degradata la qualità di immagini.

Per evitare la distorsione e ottenere un'immagine unita di elevata qualità, un metodo possibile è quello di utilizzare solo il centro dell'immagine. Tuttavia questo approccio aumenterà il numero di immagini acquisite e i tempi di esecuzione (Figura 5).

Nella versione 4.3.1 del cellSens APEX è stata aggiunta una funzione per compensare questa distorsione (Figura 6). In questa funzione l'entità della distorsione è misurata per ogni obiettivo mediante un vetrino di taratura dedicato. In seguito, quando si acquisisce un'immagine unita, la distorsione viene corretta in base all'entità di distorsione misurata per ogni immagine in un campo visivo.

3. Miglioramento del flusso di lavoro

Il microscopio APX100 esegue automaticamente l'intero processo, dall'acquisizione delle immagini all'unione mediante una serie di flussi di lavoro, rendendo possibile l'efficiente acquisizione di immagini unite.

Inoltre il microscopio APX100 è dotato di un navigatore di campione smart che ottimizza il flusso di lavoro sperimentale. Il navigatore di campione smart permette di rilevare automaticamente i campioni dall'acquisizione di immagini macro in 10 secondi. La funzionalità Convert Sample Area to Scan Area (conversione dell'area di campionamento all'area di scansione) integrata nella versione 4.2 del software cellSens APEX consente all'utente di definire l'area di campionamento rilevata come area di acquisizione dell'unione (Figura 7).

Questo permette un'ottimizzazione considerevole del flusso di lavoro: dalla preparazione pre-osservazione, passando dalla configurazione della posizione di unione, fino all'acquisizione delle immagini.

Conclusioni

Il microscopio a fluorescenza da banco APEXVIEW APX100 adesso offre una migliore qualità delle immagini e precisione delle immagini unite, oltre a un'ottimizzazione dell'efficienza sperimentale dalla definizione delle immagini alla loro acquisizione. Oltre a migliorare l'algoritmo di unione del software, i nostri ingegneri hanno preso in considerazione la correzione dei fattori ottici, in modo da poter assicurare i migliori risultati.

In sintesi, i miglioramenti di unione delle immagini includono:

• Migliore precisione dell'area unita, incluso il frame di sfondo
• Migliore precisione attraverso la correzione dell'errore di ingrandimento
• Migliore qualità dell'immagine attraverso la correzione della distorsione
• Ottimizzazione del flusso di lavoro nell'acquisizione di immagini unite di ampia area e elevata risoluzione

Autore

Takuma Kimura

Ricerca e Sviluppo, Sviluppo Software, Evident