Verbesserungen beim Stitching von Bildern mit dem APEXVIEW APX100 Fluoreszenzmikroskop als Tischgerät

Einführung

Das APEXVIEW APX100 Fluoreszenzmikroskop als Tischgerät wird zur Beobachtung von Zellen und Gewebeproben verwendet. Bei Gewebeproben im Speziellen kann es erforderlich sein, die Gesamtstruktur der Probe nach relevanten Bereichen zu durchsuchen, deren Größe über das Sehfeld des Mikroskops hinausgeht.

Das Zusammensetzen (Stitching) mehrerer Einzelbilder aus dem Sehfeld zum Erhalt eines großflächigen, hochauflösenden Bildes ist daher eine wichtige Funktion bei der Betrachtung von Gewebeproben. Die folgenden drei Punkte sind für das Stitching von Bildern wichtig.

1. Stitching-Genauigkeit

Das zusammengesetzte Bild wird durch Bewegen des motorgesteuerten XY-Tisches für jedes Sehfeld erstellt.

Da jedoch eine gewisse Fehlausrichtung auf dem XY-Tisch auftritt, ist das zusammengesetzte Bild in Bezug auf die einzelnen Sehfelder versetzt, wenn die Position für das Stitching nur durch die XY-Koordinaten der einzelnen Sehfelder bestimmt wird. Die Stitching-Position wird daher durch die Suche im Bild mittels Bildverarbeitung bestimmt. Beim Stitching von Bildern muss jegliche Abweichung vermieden werden, da sie die anschließende Bildanalyse beeinträchtigt.

2. Qualität zusammengesetzter Bilder

Optische Faktoren am Rand des Sehfeldes beeinträchtigen die Bildqualität auf unterschiedliche Weise. Es ist jedoch wichtig, beim Erstellen eines zusammengesetzten Bildes eine Verschlechterung der Bildqualität zu vermeiden.

3. Durchsatz

Das Stitching von Bildern erfordert Genauigkeit und hochwertige Einzelbilder. Daher dauert es eine Weile, die Einzelbilder jedes Sehfelds aufzunehmen, die zum Erstellen eines zusammengesetzten Bilds erforderlich sind. Die Verarbeitung der zusammengesetzten Bilder nach der Bildaufnahme ist sogar noch zeitaufwändiger, was den experimentellen Arbeitsablauf behindert. Für die Erfassung zusammengesetzter Bilder und den effizienten Erhalt experimenteller Daten sind Bildqualität und Durchsatz in gleichem Maße wichtig.

Verbesserungen beim Stitching von Bildern mit dem APX100 Mikroskop

Die Aufnahme von zusammengesetzten Bildern ist eine der Hauptanwendungen des APX100 Mikroskops.

Daher wurde die Qualität zusammengesetzter Bilder durch ein Software-Upgrade optimiert. Gleichzeitig wurde die experimentelle Effizienz bei Verwendung des Mikroskops APX100 verbessert.

Die cellSens APEX Software, die Steuerungssoftware des APX100 Mikroskops, bietet in der Version 4.3.1 drei wesentliche Verbesserungen der Bild-Stitching-Funktion.

1. Verbesserte Stitching-Genauigkeit

Verbesserung des Stitching-Algorithmus

Das Stitching nebeneinander liegender Bilder im Sehfeld erfolgt durch Bildverarbeitung. Bei der Vorgängerversion wurden die Bilder unmittelbar nach jedem einzelnen Sehfeld zusammengesetzt (sequentielles Stitching).

Beim sequentiellen Stitching enthält der zusammengesetzte Bereich nur eine geringe Menge an Informationen, wenn es sich bei dem angesetzten Teil der benachbarten Sehfeldbilder nur um einen Hintergrundbereich ohne Probe handelt. Dies führt zu einer Fehlausrichtung beim Stitching.

In der cellSens APEX Softwareversion 4.3.1 wurde die Ausrichtung verbessert. Der Stitching-Algorithmus speichert nun Bilder eines bestimmten Sehfeldbereichs, bis die optimale Position erreicht ist, und sucht dann innerhalb des gespeicherten Bereichs die optimale Position (Abbildung 1).

Beim sequentiellen Stitching können für die Ausrichtung nur bereits positionierte Einzelbilder verwendet werden. Bei der Stitching-Methode mit Speicherung eines Bildes aus einem bestimmten Bereich von Sehfeldern kann das auszurichtende Bild aus dem bereits angesetzten Bild und dem Bild innerhalb des beibehaltenen Bereichs positioniert werden.

Mit dieser aktualisierten Methode ermöglicht der neue Algorithmus der Softwareversion 4.3.1 nun den Erhalt eines zusammengesetzten Bildes ohne Versatz, auch in dem zusammengesetzten Bereich, der den Hintergrund einschließt (Abbildung 2).

Die Zeitdauer zur Erstellung zusammengesetzter Bilder ist in der Version 4.3.1 unverändert.

Korrektur optischer Phänomene mit negativer Auswirkung auf die Stitching-Genauigkeit

Optische Faktoren wie Vergrößerungsfehler können die Stitching-Genauigkeit beeinträchtigen. Die cellSens APEX Software verfügt über eine Funktion zur Kompensation dieses optischen Phänomens.

Vergrößerungskorrekturfunktion

Objektive weisen einen leichten Vergrößerungsfehler auf. Durch die Korrektur dieses Fehlers ist ein genaueres Stitching möglich.

Die Gesamtvergrößerung des APX100 Mikroskops, einschließlich des Objektivs, kann mithilfe der Vergrößerungskorrekturfunktion korrigiert werden, die ab APEX Softwareversion 4.2 verfügbar ist. So können hochpräzise zusammengesetzte Bilder erzeugt werden (Abbildung 3).

Da die Vergrößerungskorrektur bei jeder Bildaufnahme in Echtzeit erfolgt, ändert sich die Aufnahmezeit nicht, unabhängig davon, ob eine Korrektur erfolgt oder nicht.

2. Verbesserte Bildqualität beim Stitching

Optische Faktoren wie z. B. Verzerrungen können die Bildqualität beim Stitching beeinträchtigen. Die cellSens APEX Software verfügt über eine Funktion zur Kompensierung dieses Phänomens.

Korrekturfunktion für Verzerrungen

Wenn Bilder durch das Objektiv eines Systemmikroskops aufgenommen werden, tritt ein Phänomen auf, das als Verzerrung des Sehfelds bezeichnet wird (Abbildung 4).

Wenn beim Stitching von Bildern eine Verzerrung im Sehfeld vorliegt, werden an den vier Bildecken der Stitchingposition die Strukturen doppelt dargestellt. Durch diese doppelten Strukturen in den Ecken erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer schlechteren Bildqualität.

Eine Methode, um Verzerrungen zu vermeiden und ein qualitativ hochwertiges zusammengesetztes Bild zu erhalten, besteht darin, nur die Bildmitte zu verwenden. In diesem Fall muss aber eine größere Anzahl von Bildern aufgenommen werden, was den Durchsatz verringert (Abbildung 5).

In der cellSens APEX Version 4.3.1 wurde eine Funktion hinzugesetzt, um diese Verzerrung zu kompensieren (Abbildung 6). Bei dieser Funktion wird der Grad der Verzerrung für jedes Objektiv mit einem speziellen Kalibrierungsobjektträger gemessen. Bei der Erfassung eines zusammengesetzten Bildes wird die Verzerrung auf der Grundlage des gemessenen Verzerrungsgrads für jedes Bild in einem Sehfeld korrigiert.

3. Verbesserung des Workflows

Mit dem APX100 Mikroskop wird der Bediener durch den gesamten Ablauf, von der Bildaufnahme bis zum Stitching, automatisch geführt, was die Effizienz des Erhalts zusammengesetzter Bilder erhöht.

Das APX100 Mikroskop verfügt zudem über einen intelligenten Probennavigator, der den experimentellen Arbeitsablauf verkürzt. Der intelligente Probennavigator kann Proben aus der Aufnahme von Makrobildern in 10 Sekunden automatisch erkennen. Mit der „Convert Sample Area to Scan Area“-Funktion in der cellSens APEX Software Version 4.2 kann der Bediener den erkannten Probenbereich als Stitching-Erfassungsbereich festlegen (Abbildung 7).

Dadurch wird der Arbeitsablauf von der Vorbereitung vor der Beobachtung über die Einstellung der Stitching-Position bis zur Bildaufnahme erheblich verkürzt.

Fazit

Das APEXVIEW APX100 Fluoreszenzmikroskop als Tischgerät bietet nun eine verbesserte Bildqualität und Genauigkeit von zusammengesetzten Bildern sowie eine optimierte experimentelle Effizienz von der Bildeinstellung bis zur Bildaufnahme. Neben der Verbesserung des Stitching-Algorithmus der Software wurden im Hinblick auf optimale Leistung auch Korrekturfunktionen für optische Faktoren hinzugefügt.

Die Verbesserungen beim Stitching von Bildern zusammengefasst:

• Verbesserte Genauigkeit im zusammengesetzten Bereich, einschließlich des Hintergrundbildes
• Verbesserte Genauigkeit durch Korrektur des Vergrößerungsfehlers
• Verbesserte Bildqualität durch Korrektur von Verzerrungen
• Verkürzter Arbeitsablauf zur Erfassung großflächiger, hochauflösender, zusammengesetzter Bilder

Autor

Takuma Kimura

R&D, Software Development, Evident