La reproducibilidad en la microscopía confocal depende de más factores que la preparación de la muestra y la técnica del usuario. El rendimiento del instrumento, la estabilidad de la iluminación, la sensibilidad de detección, los ajustes de adquisición y la captura de metadatos pueden variar de una sesión a otra.

Estas variables son especialmente difíciles de controlar en instalaciones de imagen compartidas, donde varios investigadores con distintos niveles de experiencia utilizan el mismo instrumento. Un enfoque más coherente de « » comienza por identificar qué condiciones pueden variar y acercar su medición y control al propio instrumento.

Para obtener una explicación más detallada y una evaluación práctica de las instalaciones, descarga el informe técnico «Garantizar la reproducibilidad confocal antes de que los usuarios toquen el microscopio».

Por qué resulta difícil garantizar la reproducibilidad en las instalaciones de imagen compartidas

La reproducibilidad resulta difícil en las instalaciones de imagen compartidas porque los diferentes usuarios, las condiciones cambiantes del instrumento y los metadatos incompletos pueden afectar a la imagen final. El personal de la instalación debe dar apoyo a investigadores con distintos niveles de experiencia, pero no puede observar cada decisión de configuración ni verificar cada condición de adquisición en tiempo real.

Un estudio británico de 2022, citado en el informe técnico descargable, reveló una gran variabilidad en la gestión de las instalaciones centrales, en las que el mismo equipo de dos personas se encargaba de entre 20 y 280 usuarios. Esto dificulta la supervisión manual, sobre todo cuando la variabilidad puede no hacerse evidente hasta que se comparan las imágenes entre sesiones, usuarios o lotes de muestras.

El reto de la documentación es igualmente importante. Una revisión de 2020 de 240 artículos de investigación, a la que también se hace referencia en el informe, reveló que solo el 17,7 % de los artículos sobre microscopía de fluorescencia cumplían los estándares mínimos para informar sobre los parámetros de adquisición y los metadatos del equipo. Por lo tanto, pueden faltar detalles importantes en el registro publicado, incluso cuando las imágenes resultantes parezcan adecuadas para el análisis.

La reproducibilidad comienza antes de que se capture la primera imagen. Depende de si el sistema es capaz de medir y controlar las condiciones que determinan la imagen, en lugar de depender por completo de la memoria, la formación y la documentación manual del usuario.

Por qué la potencia del láser y los ajustes del software no son suficientes

Los porcentajes del software describen un ajuste seleccionado, no necesariamente la cantidad de potencia del láser suministrada a la muestra. Un registro de sesión que anota un ajuste del láser del 10 % documenta la posición del dial, pero no confirma cuánta iluminación llegó a la muestra durante la adquisición.

Un estudio, citado en el informe técnico descargable, describió una variación de la potencia del láser de hasta 50 veces entre sistemas confocales del mismo fabricante. Según el mismo informe, en una sola sesión de tres horas, los láseres de estado sólido suelen fluctuar entre un 25 % y un 50 %.

Por lo tanto, un mismo ajuste de software puede corresponder a condiciones de iluminación diferentes entre instrumentos o de una sesión a otra. Para la obtención de imágenes cuantitativas, un porcentaje registrado no basta para explicar una diferencia de intensidad. La cuestión relevante no es solo qué ajuste seleccionó el usuario, sino qué potencia emitió realmente el instrumento en el momento de la adquisición.

Esta distinción es el punto de partida para la reproducibilidad a nivel del instrumento: separar el comando de software del rendimiento medido del instrumento.

Por qué la reproducibilidad debe trasladarse al nivel del instrumento

La reproducibilidad debe trasladarse al nivel del instrumento porque las instalaciones compartidas no pueden basarse únicamente en la formación de los usuarios y la supervisión manual para controlar todas las condiciones que afectan a una imagen. El mantenimiento rutinario de los microscopios y las comprobaciones para confirmar que el sistema funciona dentro de los parámetros esperados también suponen una carga de tiempo significativa para el personal de las instalaciones.

El control de calidad a nivel del instrumento puede respaldar varias partes del proceso de obtención de imágenes:

• Iluminación: un sistema de monitorización de la potencia del láser puede medir la salida del láser comparándola con un valor de referencia de la instalación y facilitar la corrección cuando varíe la potencia suministrada.
• Rendimiento del instrumento: un sistema de monitorización del rendimiento del microscopio puede evaluar la potencia del láser, la sensibilidad de detección y el rendimiento de la obtención de imágenes de forma programada.
• Detección: La detección con resolución fotónica puede proporcionar una base más fiable para comparar la intensidad entre sesiones cuando la configuración óptica se mantiene constante.
• Configuración del flujo de trabajo: Las herramientas automatizadas pueden ayudar a estandarizar el posicionamiento de las muestras, el enfoque, el ajuste de la potencia del láser y los parámetros de arranque para los distintos usuarios que se turnan.

Cualquier variación que se produzca en cualquiera de estas capas puede propagarse a los datos resultantes, incluso cuando el resto de condiciones estén bien controladas. En conjunto, estas capacidades pueden garantizar que las condiciones de adquisición sean comparables entre sesiones y usuarios en el mismo sistema.

¿Cómo favorece el FLUOVIEW™ FV5000 la obtención de imágenes reproducibles?

El microscopio confocal de barrido láser FLUOVIEW™ FV5000 de Evident permite obtener imágenes reproducibles mediante la cuantificación por recuento de fotones, la corrección de la deriva del láser, la supervisión programada del rendimiento y herramientas de flujo de trabajo automatizadas en configuraciones compatibles.

Sus detectores SilVIR™ permiten la cuantificación a nivel de fotón, mientras que el monitor de potencia del láser ayuda a mantener una salida láser constante entre sesiones. El monitor de rendimiento del microscopio evalúa la sensibilidad del sistema y la consistencia de las imágenes, lo que ayuda al personal del centro a identificar cambios en el rendimiento del instrumento en cuestión de minutos. El software FLUOVIEW Smart™ ofrece herramientas automatizadas que pueden ayudar a simplificar la configuración rutinaria para usuarios con distintos niveles de experiencia.

Obtenga más información sobre el software FLUOVIEW Smart y su enfoque de flujos de trabajo confocales intuitivos y mejorados con IA.

Para conocer más a fondo cómo SilVIR facilita la obtención de imágenes confocales cuantitativas, lea el informe técnico: Sistema de detectores SilVIR de última generación para el microscopio confocal láser FLUOVIEW FV5000.

Establezca una base de reproducibilidad más sólida

La reproducibilidad confocal depende del control de las condiciones que dan forma a una imagen, no solo de la revisión de la imagen tras su adquisición. La potencia del láser, el comportamiento del detector, el rendimiento óptico, las decisiones de configuración y los metadatos contribuyen todos ellos al registro asociado a un experimento.

La automatización a nivel del instrumento puede integrar la calibración, la supervisión del rendimiento, la configuración de la adquisición y la generación de informes en el flujo de trabajo básico. En el caso de las instalaciones de imagen compartidas, este enfoque puede ayudar a los investigadores a trabajar con mayor confianza en todas las sesiones, al tiempo que proporciona a los responsables de las instalaciones pruebas más claras cuando una imagen o un experimento requieren una investigación.

Descarga el informe técnico «Garantizar la reproducibilidad de la microscopía confocal antes de que los usuarios utilicen el microscopio» para descubrir cómo interactúan estas capas y evaluar tu centro con la lista de comprobación de ocho puntos.