Pour travailler à domicile et respecter les règles de distanciation sociale, le personnel de laboratoire doit utiliser des plates-formes informatiques de travail à distance pour communiquer et rester productif. Cette nouvelle organisation du travail signifie que les laboratoires doivent adapter leurs méthodes pour tirer pleinement parti des plates-formes de travail à distance. Si vous ne savez pas trop comment mettre en œuvre cette adaptation de vos méthodes de travail, cet article de blogue peut vous aider.

Voici six conseils pour pratiquer la microscopie à distance dans de bonnes conditions :

1. Déterminer quelles sont les plates-formes informatiques disponibles dans votre laboratoire.

Vos capacités de travail à distance dépendent fortement de l’infrastructure informatique de votre laboratoire.

Pour planifier la microscopie à distance, vérifiez d’abord quels outils ou logiciels de réunion Web peuvent être utilisés, si le réseau de votre laboratoire est soumis à des restrictions et tout autre facteur à prendre en compte pour l’infrastructure informatique.

Vérifiez également qu’il n’y aura pas d’interruption de logiciel inattendue. Par exemple, une mise à jour de Windows exécutée durant la nuit peut nécessiter un redémarrage qui empêchera l’utilisation du système à distance. Si cela est autorisé par la politique de votre laboratoire pour les systèmes informatiques, la désactivation de la mise à jour peut permettre d’éviter ce problème.

2. Planifiez et organisez votre travail d’observation en déterminant les capacités de travail à distance dont vous disposez.

L’étape suivante consiste à planifier et organiser votre observation à distance en déterminant ce qui peut être fait à distance et ce qui doit être fait sur place.

Cela peut dépendre de votre microscope et de votre type d’expérimentation. Avec les microscopes entièrement motorisés, vous pouvez généralement travailler à distance après avoir configuré les conditions d’observation, mais gardez à l’esprit ce qui suit à titre de directives générales :

• Ce qui doit être fait sur place : mise en place de l’échantillon et réglage de la mise au point, réglage de la bague de correction, application d’huile (si besoin) et configuration pour une utilisation à distance.
• Ce qui peut être fait à distance : correction après une mise au point approximative, réglages fins pour l’observation, analyse ou partage d’images

Même si votre système n’est pas conçu pour une utilisation à distance, n’hésitez pas à entrer en contact avec votre fournisseur pour trouver des solutions.

Par exemple, la plupart des microscopes professionnels sont conçus de manière modulaire et peuvent être transformés en système motorisé. De plus, de nos jours, il existe de nombreux outils de microscopie spéciaux et plates-formes de réunion Web pour la surveillance, le partage d’images ou l’utilisation d’un microscope à distance.

D’une manière générale, l’observation sous huile est déconseillée en microscopie à distance. En effet, l’huile ne peut pas être appliquée à distance et sans huile la qualité des images risque de ne pas être optimale et, si elle est appliquée sur place, elle peut endommager vos composants optiques en cas d’excès ou d’un mauvais nettoyage après usage. La seule situation où il est possible d’utiliser de l’huile est avec un scanner de lames pour la recherche qui applique l’huile automatiquement. Ceux qui ont une grande habitude de l’utilisation de l’huile peuvent envisager de l’appliquer avant de commencer l’expérience.

Figure 1. Tâches devant être effectuées sur place pour la microscopie à distance. Notez qu’avec certaines configurations de microscope, les conditions d’éclairage peuvent être contrôlées à distance.

3. Réglez la parfocalité.

L’importance du réglage de la parfocalité lors de l’observation à travers un oculaire est souvent sous-estimée étant donné qu’il est très facile et rapide de faire la mise au point fine après avoir changé d’objectif. Mais pour la microscopie à distance, la parfocalité entre les différents grossissements devient un élément essentiel pour l’obtention d’images toujours nettes avec tous les objectifs.

Un réglage parfait de la parfocalité vous évitera de devoir réajuster la mise au point à chaque changement de grossissement. Consultez notre guide pratique pour le réglage de la parfocalité avec une caméra. Comme l’indique le guide, il est important de régler la parfocalité à travers les oculaires avant de régler la parfocalité de la caméra.

4. Vérifiez la planéité de la platine.

La planéité de la platine ne peut être corrigée à distance, et un défaut de planéité peut vous faire perdre la mise au point sur l’échantillon si vous négligez cet aspect. Heureusement, il est très facile de vérifier la planéité de la platine. Au laboratoire, il suffit de déplacer la platine selon des axes X et Y en l’observant avec un objectif à fort grossissement, lequel est caractérisé par une faible profondeur focale (voir explication plus loin).

Si la planéité de la platine n’est pas correctement réglée, le plan focal peut se décaler par rapport au plan Z de l’échantillon, ce qui peut faire perdre la mise au point sur l’échantillon pendant le déplacement de la platine selon les axes X et Y. Alors que certains inserts de platine de fabricants tiers sont dotés de vis de mise à niveau, l’insert d’Olympus est conçu pour former une platine parfaitement plane sans aucun réglage.

5. Suivez les meilleures pratiques pour la mise au point à distance de votre microscope.

La mise au point est l’une des opérations à distance les plus difficiles à exécuter, et pour compliquer encore les choses, une collision entre votre objectif et l’échantillon durant le réglage risque d’endommager l’objectif et l’échantillon de manière irréversible. Même dans le moins mauvais des cas où l’échantillon tomberait du porte-échantillon d’un microscope inversé, cela ne pourrait être résolu à distance.

Alors, quelle est la manière la plus efficace d’éviter ces situations ? Suivez ces cinq règles générales pour la mise au point à distance :

• Assurez une surveillance minutieuse : cela est plus facile à dire qu’à faire. Les principaux facteurs limitants sont la fréquence d’images en temps réel et le délai par rapport au déplacement selon l’axe Z. Il existe cependant plusieurs façons d’améliorer ces facteurs. Tout d’abord, le regroupement ou le sous-échantillonnage de l’acquisition des images est un moyen général d’améliorer la fréquence d’images. Certains outils de conférence Web peuvent également limiter la fréquence d’images et causer des délais. Ces outils comportent un menu de réglages permettant d’ajuster la qualité et la vitesse des images. Nous vous recommandons de donner la priorité à la vitesse, en particulier lorsque vous recherchez le plan focal.
• Utilisez une approche par étapes avec une grande profondeur de champ : cette approche peut vous permettre d’éviter que chaque image se retrouve hors de la profondeur de champ et que vous ne puissiez plus voir quoi que ce soit. Si une image est extrêmement floue, il peut être impossible de déterminer si la mise au point doit être réglée plus haut ou plus bas. Pour cette raison, essayez d’éviter de perdre la mise au point sur la cible hors de la profondeur de champ. La profondeur de champ est déterminée par l’ouverture numérique (NA). Un objectif à grande ouverture numérique possède une faible profondeur de champ. Par conséquent, nous vous recommandons de régler la mise au point en commençant par une faible ouverture numérique et finissant par une grande ouverture numérique, généralement d’un faible grossissement à un fort grossissement. Avec un microscope confocal, la même approche avec « une grande profondeur de champ » peut être utile. Comme une faible ouverture confocale implique une faible profondeur de champ, essayez une grande ouverture pour repérer la cible et faire la mise au point lorsque vous ne trouvez pas l’échantillon ou s’il est trop flou. Une fois la mise au point parfaitement réglée, définissez la confocalité et la puissance laser appropriées pour l’acquisition des images.
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• Figure 2. À gauche : les objectifs à faible grossissement ont généralement une faible NA et une grande profondeur de champ, ce qui permet de visualiser une plus grande plage de l’axe Z. À droite : les objectifs à fort grossissement ayant une grande NA ont une faible profondeur de champ. Ils vous permettent de ne voir que les échantillons sur lesquels la mise au point a été faite, mais avec un risque de perdre la mise au point.
• Amorcez votre approche de loin : comme mentionné plus haut, une collision entre votre échantillon et l’objectif est le scénario catastrophe que vous devez éviter à tout prix, il est donc très important de faire l’approche avec précaution en commençant à une certaine distance. Si vous utilisez un microscope inversé, amorcez votre approche par le bas. Si vous utilisez un microscope droit, amorcez votre approche par le haut. Avant d’effectuer un déplacement important de la platine selon des axes X et Y, il est judicieux d’écarter l’objectif.
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• Figure 3. À gauche : avec un microscope inversé, amorcez votre approche par le bas ; à droite : avec un microscope droit, amorcez votre approche par le haut.
• Essayez de vous représenter votre échantillon en 3D : votre échantillon peut ne pas se trouver dans le même plan Z à différentes positions XY, et vous pouvez perdre la mise au point sur l’échantillon lorsque vous vous déplacez trop loin. Cela peut être causé par l’échantillon lui-même ou par le manque de planéité de la platine, comme nous l’avons indiqué plus haut. Lorsque vous utilisez un objectif à grande NA avec une faible profondeur de champ, il est préférable de déplacer légèrement la platine selon les axes X et Y tout en ajustant minutieusement la mise au point selon l’axe Z. Lorsque vous perdez la mise au point, passez si possible à une plus grande profondeur de champ. Si vous créez une image en mosaïque, la cartographie de la mise au point peut vous aider à définir la hauteur de mise au point.
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• Figure 4. Si les échantillons ne se trouvent pas dans le même plan Z, vous perdez la mise au point si vous déplacez trop la platine (a). Dans ce cas, il faut réajuster la mise au point (b) ou essayer un autre objectif.
• N’oubliez pas la limite de la mise au point : pour protéger votre échantillon et votre objectif, il est possible que la distance de mise au point ait été limitée. La fonction de limitation de la mise au point restreint la distance de déplacement selon l’axe Z. Généralement, il n’est pas nécessaire de modifier cette limite. Néanmoins, si quelqu’un en a modifié le réglage ou si votre échantillon est placé dans un récipient à fond épais, cette fonction peut vous empêcher de vous rapprocher suffisamment de votre échantillon pour l’observation. Notez que ce réglage ne peut être effectué que directement sur le microscope, car il faut vérifier la distance physique entre l’objectif et l’échantillon.

Si les astuces données ici pour effectuer la mise au point à distance sont certainement pratiques, l’automatisation de la mise au point peut vous faciliter encore plus la tâche. Pour en savoir plus sur la mise au point automatisée, lisez notre article de blogue intitulé « Quatre conseils pour une imagerie prolongée des cellules vivantes et une réduction du temps passé en laboratoire ».

6. Utilisez une carte pour identifier la position XY.

Un autre problème de l’observation à distance est la difficulté à se repérer par rapport à l’échantillon observé. Cette difficulté est due à la fréquence d’images limitée, au délai par rapport à l’image en temps réel, au champ de vision limité et à l’impossibilité de voir directement la platine du microscope.

L’utilisation d’une carte vous permet de résoudre ce problème. En configurant la platine motorisée de façon adéquate, vous pouvez facilement créer une carte à un faible grossissement. Le temps passé à créer une carte en vaut vraiment la peine, car celle-ci peut vous permettre de repérer immédiatement et en continu l’endroit que vous observez ; plus intéressant encore, vous pouvez passer d’un endroit à l’autre en cliquant simplement sur la position souhaitée sur la carte.

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