Introduction à la méthode de gradient de contraste

1. Introduction

Depuis leur invention au XVIe siècle, les microscopes optiques ont grandement contribué à la recherche biologique, notamment à la découverte de microorganismes et des érythrocytes. Au XIXe siècle, la technologie de coloration des échantillons s’est développée et les structures transparentes pouvaient être colorées avec des agents de contraste de couleurs pour les rendre plus faciles à voir. Malheureusement, la coloration est toxique, ce qui limite son utilisation sur des échantillons vivants. À partir du XXe siècle, diverses méthodes permettant de voir des objets transparents non colorés, comme la microscopie à contraste de phase, ont été développées et sont encore aujourd’hui des outils indispensables pour la recherche biologique.

2. Variantes des méthodes de contraste de phase

Les méthodes de visualisation de phase courantes pour observer des objets transparents sans coloration sont brièvement expliquées avec chacun des arrangements d’éléments optiques sur la figure 1. Les méthodes de visualisation de phase traditionnelles exigent de positionner des éléments optiques spécifiques dans la pupille du condenseur et la pupille de l’objectif.

La méthode de contraste de phase (figure 1a) combine un condenseur dédié avec une ouverture en forme d’anneau et un objectif dédié contenant un anneau de film de phase. Parmi les rayons qui passent par l’ouverture en forme d’anneau du condenseur, ceux qui passent directement à travers de l’échantillon traversent le film de phase de la pupille de l’objectif. Les rayons déviés par l’échantillon passent quant à eux à l’extérieur du film de phase, ce qui produit un contraste de lumière et d’ombre au point où les deux composantes interfèrent l’une avec l’autre. Une caractéristique de ce processus est que des taches lumineuses, appelées halos, apparaissent à des étapes où la distribution de l’indice de réfraction change dans l’échantillon. Les échantillons épais ne conviennent pas à cette méthode, car le halo produit est trop important.

La méthode de contraste interférentiel différentiel (figure 1b) utilise un interféromètre à cisaillement polarisé avec des prismes de Wollaston complémentaires au niveau de la pupille du condenseur et de la pupille de l’objectif. L’image de l’échantillon devient une image double légèrement décalée dans une direction fixe, et le saut d’indice de réfraction de l’échantillon est ombragé pour le faire apparaître en trois dimensions. Étant donné que l’interférence de polarisation est utilisée, l’observation n’est pas possible s’il y a une boîte de Pétri en plastique ou un autre objet qui provoque une distorsion polarisée dans le trajet optique.

La méthode de contraste par modulation (figure 1c) limite le faisceau d’éclairage dans une direction à l’aide de l’ouverture en forme de fente de la pupille du condenseur. Le guidage du faisceau lumineux fait en sorte que la partie rectiligne de la lumière dans l’échantillon apparaît en gris, tandis que le contraste de la partie réfractée change en fonction de la direction de réfraction grâce au modulateur de la pupille de l’objectif. En transmettant ou en blindant une partie de la lumière, il est possible d’obtenir une image tridimensionnelle semblable à celle obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel. Étant donné que la méthode de contraste par modulation n’a pas recours à la polarisation, on peut utiliser des récipients en plastique, comme des boîtes de Pétri. Cependant, la résolution est légèrement réduite avec cette méthode, car le fait de limiter la direction du faisceau d’éclairage signifie aussi une petite ouverture numérique (ON) d’éclairage.

Figure 1 – Disposition des éléments optiques de diverses méthodes de visualisation de phase

Éléments optiques nécessaires pour chacune des diverses méthodes de visualisation de phase. a. Méthode de contraste de phase ; b. Méthode de contraste interférentiel différentiel ; c. Méthode de contraste de modulation ; d. Méthode de contraste de gradient

3. Méthode de contraste de gradient

La méthode de contraste de gradient (figure 1d) est caractérisée par la génération d’une image pseudo-tridimensionnelle similaire à celle obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel. Alors que d’autres méthodes de visualisation de phase nécessitent plusieurs composants optiques pour générer un contraste dans des échantillons non colorés, un contraste de gradient peut être obtenu en insérant simplement un filtre à gradient à densité neutre dans la pupille de l’objectif.

Principe de la méthode de contraste de gradient

Le filtre à gradient à densité neutre inséré à la position de la pupille de l’objectif a une transmission décroissante monotone dans une direction. Le diamètre d’ouverture du condenseur projeté à la position de la pupille de l’objectif est réduit dans une certaine mesure par rapport au diamètre de la pupille de l’objectif. Lorsque la distribution de l’indice de réfraction de l’échantillon est plane, l’image de l’ouverture du condenseur est projetée à la position centrale de la pupille de l’objectif et est ensuite influencée par la transmittance près du centre du filtre à gradient à densité neutre (figure 2a). Lorsqu’il y a une inclinaison dans la distribution de l’indice de réfraction de l’échantillon, l’image de l’ouverture du condenseur est décalée du centre du filtre à gradient à densité neutre, de sorte que lorsque le faisceau lumineux se réfracte à l’emplacement de l’échantillon, la transmittance globale par le filtre à gradient à densité neutre change (figures 2b et c). En conséquence, l’image est acquise à une luminosité correspondant à l’inclinaison de l’indice de réfraction de l’échantillon, et la distribution de l’indice de réfraction de l’échantillon semble tridimensionnelle (figure 2d).

L’ouverture du condenseur peut être réglée à l’aide du diaphragme d’ouverture. Lorsque l’ouverture est relativement grande, le changement de luminosité attribuable à l’inclinaison de l’indice de réfraction de l’échantillon peut ne pas être suffisant. Par conséquent, l’image acquise avec le capteur d’image est accentuée et affichée avec un contraste facile à voir.

Figure 2 – Illustration du principe de la méthode de contraste de gradient

Description du principe de contraste entre la lumière et l’ombre sur un objet de phase au moyen de la méthode de contraste de gradient. a. Là où la distribution de phase de l’échantillon est plane, le faisceau lumineux va droit et passe près du centre du filtre à gradient à densité neutre. b, c. Si la distribution de phase de l’échantillon est inclinée, les rayons de lumière se réfractent de sorte que la direction de l’inclinaison passe soit par la partie la plus claire du filtre à gradient à densité neutre (b) soit (c) par la partie la plus foncée. d. L’image est observée avec un contraste de lumière et d’ombre selon la direction d’inclinaison de la distribution de phase de l’échantillon.

Caractéristiques de la méthode de contraste de gradient

L’image de phase produite par la méthode de contraste de gradient présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes classiques de visualisation de phase. La méthode de contraste de gradient peut être appliquée à des échantillons épais, car il n’y a pas de halos contrairement à la méthode de contraste de phase. Puisqu’elle n’est pas basée sur la polarisation, contrairement à la méthode de contraste interférentiel différentiel, la méthode de contraste de gradient peut générer des images pseudo-tridimensionnelles d’échantillons même à travers des récipients en plastique. De plus, étant donné que l’ouverture numérique de l’éclairage est plus grande que celle des autres méthodes, elle est moins sensible aux problèmes causés par l’imagerie à travers le couvercle d’une boîte de Petri avec des gouttelettes d’eau. Cette caractéristique empêche également la détérioration de la résolution attribuable à l’utilisation d’un élément de blindage dans la méthode de contraste par modulation. Un autre avantage pratique est qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser un objectif dédié ni de permuter des éléments lors du changement d’objectif, ce qui rend l’observation plus rapide et plus facile.

Tableau 1 – Comparaison des méthodes d’observation

Configuration optique pour la méthode de contraste de gradient

La configuration optique du système d’imagerie APX100 est illustrée à la figure 3. La lumière est irradiée vers l’échantillon à travers le trajet optique et l’image se forme sur la surface d’imagerie.

Un filtre à gradient à densité neutre est placé à une position qui est conjuguée à la position de la pupille de l’objectif. Ce filtre n’entre dans le trajet optique que lorsque le système est réglé pour la méthode de contraste de gradient. Le diamètre de l’ouverture du condenseur est automatiquement réglé à la valeur optimale en fonction du grossissement et du diamètre de la pupille de l’objectif.

Figure 3 – Configuration optique du microscope à fluorescence de paillasse APEXVIEW™ APX100 pour l’observation en contraste de gradient d’échantillons non colorés

Applications de la méthode de contraste de gradient

Ci-dessous, les cellules HeLa dans les récipients 1 et 2 ont été observées avec un objectif 10x. Les images ont été acquises en utilisant les quatre méthodes d’observation présentées précédemment afin que les images puissent être comparées.

1. Boîte à fond en verre ※ Le couvercle supérieur en plastique est en place
2. Plaque à 12 puits ※ Les gouttelettes d’eau adhèrent au couvercle supérieur en plastique

Comparaison des résultats :

1. L’image obtenue avec la méthode de contraste de gradient est comparable aux images obtenues à l’aide des méthodes de contraste de phase et de contraste par modulation. Dans l’image obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel, l’efficacité de la polarisation est réduite avec le couvercle en plastique, de sorte que le contraste est faible.
2. Par rapport à d’autres méthodes d’observation, l’image obtenue à l’aide de la méthode de contraste de gradient a un champ d’observation plus uniforme et un bon contraste. L’ouverture numérique de l’éclairage est plus grande par rapport aux autres méthodes d’observation, et elle est moins influencée par les corps étrangers sur l’échantillon et les gouttelettes d’eau dans le récipient.

4. Récapitulatif

La méthode de contraste de gradient est une méthode d’observation d’objet de phase ayant recours à une configuration optique simple qui nécessite seulement l’ajout d’un filtre à gradient à densité neutre à la pupille de l’objectif. Elle fonctionne bien pour observer des échantillons vivants transparents sans coloration. Les avantages de la méthode de contraste de gradient comparativement à la méthode d’observation d’objets de phase traditionnelle sont les suivants :

• Elle convient bien aux échantillons épais
• Elle est efficace sur les échantillons contenus dans une boîte de Pétri en plastique
• Les observations peuvent être faites à travers le couvercle d’une boîte de Pétri, ce qui réduit le risque de contamination des cellules cultivées
• Elle ne requiert pas d’objectif dédié
• Elle n’exige pas de changer l’élément lors du changement d’objectif

Auteurs

Shinichi Hayash, R&D, Optique de pointe et génie biologique, Optique de pointe 2, Evident
Yoshihiro Kazama, R et D, Ingénierie optique, Ingénierie optique 2, Evident

Produits utilisés pour cette application