Il team di ricerca guidato dal Professor Sato dell'Università Keio ha sviluppato una tecnologia innovativa con potenziali applicazioni nella ricerca sulle malattie del fegato, nella valutazione dei farmaci e nel trapianto di cellule. In definitiva, questi progressi indicano che la ricerca sul fegato sta entrando in una nuova era trasformativa.

Il fegato è un organo multifunzionale essenziale per la sopravvivenza: metabolizza carboidrati, lipidi e proteine, detossifica i farmaci, e sintetizza e secerne gli acidi biliari. Tuttavia, è difficile mantenere gli epatociti umani primari in coltura ex vivo a lungo termine, il che ne limita l'impiego nella scoperta di farmaci e nella ricerca sulle malattie.

Per superare queste limitazioni, un team di ricerca guidato dal Professor Toshiro Sato del Dipartimento di Biochimica, Keio University School of Medicine, ha studiato una tecnologia di organoidi epatocitari che consente la coltura a lungo termine preservando le funzioni epatocellulari. Con questo approccio, il team è riuscito a sviluppare un modello funzionale che riproduce le principali funzioni epatiche, inclusi il metabolismo dei farmaci, la sintesi degli acidi biliari e il ciclo dell'urea.

Si prevede che questi risultati troveranno ampia applicazione, ad esempio nei test di tossicità nella scoperta di farmaci, nell'elucidazione della fisiopatologia della steatosi epatica e nel progresso della medicina rigenerativa attraverso il trapianto di cellule.

Informazioni sui ricercatori

Dottor Toshiro Sato

Professore presso il Dipartimento di Medicina Integrata e Biochimica della Facoltà di Medicina dell'Università Keio

Il professor Sato ha dato un contributo significativo alla ricerca sugli organoidi in diversi organi, tra cui intestino, fegato e pancreas, ed è impegnato nello sviluppo di tecnologie per ricostruire tessuti funzionali a partire da cellule staminali tissutali. Ricopre il ruolo di direttore di progetto per diversi programmi di ricerca, tra cui il Japan Science and Technology Agency (JST) ERATO Sato Organoid Design Project, e dirige la ricerca sugli organoidi sia a livello nazionale che internazionale.

Dottor Ryo Igarashi
Professore assistente di progetto, Dipartimento di Medicina Integrata e Biochimica, Facoltà di Medicina dell'Università Keio

Il dottor Igarashi è specializzato nelle tecnologie di coltura di organoidi epatocitari e nelle analisi funzionali, ed è impegnato nella costruzione di modelli di malattie epatiche e nella valutazione delle risposte ai farmaci.

Su quali aree della ricerca sugli organoidi si sta concentrando attualmente?

Professor Sato: Attualmente, stiamo lavorando allo sviluppo di organoidi funzionali che ricostruiscono non solo la morfologia degli organi, ma anche le loro funzioni utilizzando organoidi derivati da cellule umane. In particolare, attraverso il JST ERATO Sato Organoid Design Project, miriamo a riprodurre le reti che regolano l'omeostasi fisiologica a partire da cellule staminali tissutali. Stiamo inoltre portando avanti la costruzione di organoidi con funzioni complesse, come l'assorbimento, il metabolismo, la secrezione e la trasduzione del segnale in organi quali fegato, intestino e pancreas.

Come sono stati sviluppati organoidi epatici funzionali per replicare in vitro le principali funzioni del fegato?

Professor Sato: Il fegato svolge molte funzioni essenziali, come metabolizzare carboidrati, lipidi e proteine, detossificare i farmaci e sintetizzare acidi biliari. La disponibilità di modelli in vitro capaci di replicare queste funzioni favorirebbe notevolmente la scoperta di farmaci, la valutazione della tossicità e lo studio dei meccanismi delle malattie.

Tuttavia, gli epatociti umani primari convenzionali (PHH) perdono rapidamente la loro funzionalità dopo l'isolamento, il che li rende inadatti alla coltura a lungo termine e alla manipolazione genetica. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo utilizzato gli epatociti primari umani (PHH) come materiale di partenza per generare organoidi di epatociti proliferativi, noti anche come organoidi umani di epatociti in espansione (eHHOs). Attraverso una successiva induzione della differenziazione, abbiamo sviluppato organoidi di epatociti umani differenziati (dHHO) che mostrano una maggiore espressione di enzimi del metabolismo dei farmaci, del ciclo dell’urea e della sintesi degli acidi biliari.

Questa ricerca, condotta nell'ambito del progetto JST ERATO, mira a definire gli organoidi non semplicemente come "mini-organi", ma come "modelli funzionali" che riproducono le funzioni intrinseche degli organi in vitro. Per il fegato, è particolarmente importante costruire modelli che replichino in vivo strutture e funzioni, come la zonazione² e le strutture canalicolari biliari responsabili dell'escrezione della bile. L’attuale risultato rappresenta un importante passo avanti in questa direzione.

Dottor Igarashi: Le cellule epatiche umane primarie (PHH) sono estremamente preziose, ma il loro impiego è stato limitato dalla variabilità della vitalità e della funzionalità. Utilizzando la tecnologia attuale, abbiamo ottenuto una coltura stabile di eHHO derivati da PHH per oltre 100 giorni, con un'espansione superiore a un milione di volte. Mediante l'induzione della differenziazione, siamo riusciti a riprodurre diverse funzioni epatocellulari in vitro a livelli comparabili a quelli osservati in vivo. Questi organoidi possono anche fungere da modelli per la steatosi epatica e per disturbi metabolici congeniti, evidenziando caratteristiche come l'accumulo di goccioline lipidiche³ e le risposte ai farmaci. Hanno il potenziale per migliorare significativamente la riproducibilità dei modelli patologici e aumentare la precisione della valutazione dei farmaci.

² Zonazione: gli epatociti all'interno del tessuto epatico non sono omogenei; il fegato è composto da numerose strutture lobulari, con funzioni metaboliche distinte assegnate a regioni specifiche. Questa organizzazione, nota come zonazione, determina attività regolate a livello regionale come la gluconeogenesi, il ciclo dell'urea e il metabolismo dei farmaci.

³ Goccioline lipidiche: piccole strutture sferiche costituite principalmente da lipidi neutri che si accumulano all'interno delle cellule. Negli epatociti, l'accumulo di gocce lipidiche rappresenta un indicatore chiave della steatosi epatica, rendendolo un parametro critico da monitorare nei modelli di organoidi epatici.

In che modo la tecnologia di imaging avanzata supporta la visualizzazione e l'analisi della struttura e della funzione degli organoidi?

Professor Sato: Gli organoidi di epatociti sono relativamente spessi, il che può rendere difficile l'osservazione delle strutture interne. Il metodo a contrasto di gradiente integrato nel microscopio a fluorescenza da banco APEXVIEW™ APX100 supera questa limitazione, consentendo una chiara visualizzazione dei dettagli fini delle gocce lipidiche (Figura 1a). In particolare, nella valutazione dei modelli di malattie epatiche steatosiche, la capacità di visualizzare sia l'accumulo che la distribuzione spaziale di queste gocce costituisce un parametro fondamentale per convalidare la riproducibilità della malattia.

Il metodo a contrasto di gradiente genera immagini ad alto contrasto anche in recipienti a tenuta di coltura in plastica standard, consentendo osservazioni di alta qualità senza alterare le condizioni di coltura di routine. Inoltre, il sistema supporta obiettivi a lunga distanza di lavoro, permettendo immagini nitide degli organoidi collocati in posizioni elevate all'interno di Matrigel (Figura 1b). La possibilità di monitorare direttamente lo stato degli organoidi durante la coltura quotidiana, senza recipienti o preparazioni specializzate, offre vantaggi significativi in termini di efficienza e riproducibilità della ricerca.

Dottor Igarashi: Per l'imaging a fluorescenza o l'acquisizione di dati quantitativi, ottenere dati affidabili in modo efficiente è fondamentale. L'APX100 può ospitare fino a tre vetrini contemporaneamente, consentendo una rapida localizzazione a livello macroscopico e un funzionamento intuitivo tramite il Process Manager, che semplifica l'acquisizione di immagini composite. La sua capacità di acquisire immagini ad alta risoluzione e su ampie aree in tempi brevi consente una valutazione coerente sia dell'architettura tissutale complessiva che delle strutture locali.

In questo studio, le immagini acquisite con l'APX100 hanno chiaramente dimostrato che organoidi di epatociti umani trapiantati nel fegato di topo si sono differenziati e hanno riprodotto la struttura di zonazione del fegato, con funzioni metaboliche distribuite dalla vena porta⁴ alla vena centrale⁵ (Figura 2).

Grazie alla combinazione tra acquisizione di immagini ad alta fedeltà ed efficienza operativa, l'APX100 si configura come un potente strumento per ottimizzare le attività di ricerca quotidiane.

⁴ Vena porta: struttura chiave all'interno del lobulo epatico, la vena porta trasporta al fegato i nutrienti assorbiti dal tratto digerente, compreso l'intestino. Gli epatociti che circondano la vena porta svolgono funzioni legate al metabolismo dei nutrienti, come la gluconeogenesi e la disintossicazione dell'ammoniaca.

⁵ Vena centrale: struttura all'interno del lobulo epatico che raccoglie il sangue processato dagli epatociti e lo convoglia nella circolazione sistemica. Gli epatociti che circondano la vena centrale svolgono funzioni quali il metabolismo dei farmaci e il metabolismo dei lipidi.

⁶ STEM121: un anticorpo che riconosce un antigene espresso specificamente nelle cellule umane, utilizzato come marcatore per identificare le cellule umane trapiantate nel tessuto del topo.

⁷ HAL (istidina ammoniaca liasi): un enzima fortemente espresso negli epatociti che circondano la vena porta. Svolge un ruolo chiave nel metabolismo degli amminoacidi e nella gluconeogenesi, come marcatore funzionale dell'attività metabolica dei nutrienti del fegato.

⁸ CYP2E1 (Citocromo P450 2E1): un enzima che metabolizza gli xenobiotici, altamente espresso negli epatociti che circondano la vena centrale. È coinvolto nel metabolismo degli xenobiotici e dei lipidi, servendo come marcatore critico per la zonazione funzionale e la differenziazione del fegato.

Come vede l'evoluzione della sua ricerca nel campo della tecnologia degli organoidi?

Professor Sato: Guardando al futuro, puntiamo a sviluppare modelli di malattia più precisi utilizzando organoidi epatici con mutazioni genetiche specifiche della patologia, accelerando le applicazioni nella scoperta di farmaci e nella medicina rigenerativa in sostituzione della sperimentazione animale. In particolare, si prevede che la tecnologia degli organoidi è destinata a svolgere un ruolo sempre più importante come nuovo approccio terapeutico per l'insufficienza del fegato e le malattie epatiche ereditarie.

In questo contesto, i sistemi di imaging devono offrire elevate prestazioni ottiche unite a un’operatività intuitiva e facile da usare. Poiché il nostro laboratorio ospita un gran numero di studenti, la facilità d'uso è un fattore primario che influenza l'efficienza complessiva della nostra ricerca. Prevediamo che i sistemi di imaging continueranno a evolversi come infrastrutture indispensabili, consentendo ai ricercatori di acquisire dati ad alta fedeltà con maggiore velocità e coerenza.

Capacità di imaging preferite per la ricerca sugli organoidi

2. Elevata versatilità e compatibilità con recipienti a tenuta in plastica

La microscopia a contrasto di interferenza differenziale (CID) si basa sulla luce polarizzata, che viene distorta dalla birifrangenza intrinseca dei recipienti a tenuta in plastica, rendendo difficile un'osservazione accurata.

Al contrario, l’imaging a contrasto di gradiente non utilizza luce polarizzata, consentendo un imaging stabile nei recipienti a tenuta in plastica e un impiego flessibile per il monitoraggio di routine delle condizioni cellulari.

Quando utilizzato insieme a obiettivi a lunga distanza di lavoro, come la serie LUCPLFLN, l’imaging a contrasto di gradiente può accomodare campioni spessi o recipienti a tenuta con fondo rialzato, supportando l’osservazione senza restrizioni legate al tipo di campione o contenitore. Questa capacità consente un'ampia gamma di applicazioni (vedi esempio da Keio University): Figura 1(b)).

Bibliografia

Per informazioni dettagliate su questo studio, consultare la seguente pubblicazione:

Igarashi, R., Oda, M., Okada, R., Yano, T., Takahashi, S., Pastuhov, S., Matano, M., Masuda, N., Togasaki, K., Ohta, Y., Sato, S., Hishiki, T., Suematsu, M., Itoh, M., Fujii, M., and Sato, T. 2025. "Generation of Human Adult Hepatocyte Organoids with Metabolic Functions". Nature.

Dichiarazione di non responsabilità: Le opinioni e le affermazioni espresse in questa intervista sono quelle del singolo ricercatore e non riflettono necessariamente i punti di vista o le affermazioni di Evident. I prodotti e le tecnologie menzionati sono destinati esclusivamente alla ricerca e non sono progettati per applicazioni cliniche o diagnostiche.