인체 장기를 모사하는 오가노이드는 신약 스크리닝 및 질병 모델링에서 점점 더 중요한 역할을 하고 있습니다. 그러나 두꺼운 구조와 큰 구조적 특성으로 인해 현미경 검사 시 고유한 난제가 발생합니다.

일반적으로 연구자들은 전체 구조를 파악하기 위해 저배율로 탐색하고, 세부 구조를 확인하기 위해 고배율로 전환하는 방식을 사용하거나, 전체 표본을 획득하기 위해 이미지 스티칭을 활용합니다. 하지만 공기(건식) 대물렌즈는 사용이 간편한 반면, 오가노이드 내부 깊은 영역을 관찰할 때 해상도와 작업 거리 측면에서 한계를 보이는 경우가 많습니다.

고해상도 3D 이미징을 구현하려면 공초점 현미경과 액체 침지 대물렌즈(물, 오일 또는 실리콘 오일)를 결합하는 것이 표준입니다. 그러나 이러한 방식은 운용상의 문제를 동반합니다. 스테이지 이동 중 오일 접촉이 끊어질 수 있으며, 접시 표면에 남은 잔여 오일은 공기 대물렌즈로 전환할 때 이미지 품질을 저하시킬 수 있습니다.

본 글에서는 획기적인 솔루션을소개합니다. 바로 뇌 오가노이드 이미징을 위해 설계된 세계 최초의 실리콘 젤 침지 대물렌즈(LUPLAPO25XS)와 FLUOVIEW™ FV5000 공초점 레이저 주사 현미경의 조합입니다. 또한 기존 실리콘 오일 침지 대물렌즈 대비 이 광학 기술이 제공하는 세 가지 주요 장점을 살펴보겠습니다.

오가노이드 이미징 실험 프로토콜

실리콘 젤 침지의 이점을 평가하기 위해, 아래 프로토콜에 따라 제작된 오가노이드를 사용했습니다.

뇌 오가노이드 생성
인간 유도만능줄기세포(hiPSCs; line 201B7)는 eTeSR 배지(STEMCELL Technologies)를 사용하여 미분화 상태로 유지되었습니다. 뇌 오가노이드는 STEMdiff 뇌 오가노이드 키트(STEMCELL Technologies)를 이용하여 생성되었습니다. 배아체 형성, 신경외배엽 유도, 이후 오가노이드 성숙 단계로 이어지는 분화 과정은 STEMdiff 뇌 오가노이드 키트의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

면역염색 및 조직 투명화
오가노이드는 고정 후 면역염색을 진행하였습니다. 핵 염색에는 DAPI를 사용하고, 신경세포 마커로 anti-TUJ1(Alexa Fluor 488), 신경 전구세포 마커로 anti-PAX6(Alexa Fluor 594)를 적용하였습니다. 염색 이후에는 이미징 전에 Sca l eS4 조직 투명화 시약을 사용하여 샘플을 투명화하였습니다.

뇌 오가노이드 이미징에서 실리콘 젤 침지의 3가지 장점

본 실험을 통해 LUPLAPO25XS 실리콘 젤 침지 대물렌즈와 FV5000 공초점 현미경의 조합이 오가노이드 이미징에서 발생하는 주요 운용상의 문제를 어떻게 해결하는지 확인할 수 있었습니다. 주요 장점은 다음과 같습니다.

1. Z축 안정성: 접촉 손실 없는 이미징

기존 실리콘 오일 침지 방식은 렌즈와 샘플 용기 사이에 연속적인 액체 브리지가 유지되어야 합니다. 그러나 깊은 Z 스택 이미징이나 큰 폭의 Z 초점 조정 과정에서 이 브리지가 쉽게 끊어질 수 있습니다.

• 실리콘 오일의 한계: 오일 접촉이 한 번 끊어지면, 원래의 Z 좌표로 되돌아가더라도 오일이 이상적인 메니스커스를 자동으로 재형성하지 못하기 때문에 이미지가 흐려지는 경우가 많습니다. 이 경우 연구자는 오일을 다시 도포하거나 렌즈를 재조정해야 하며, 이는 실험을 중단시키는 요인이 됩니다(그림 1 참조).

• 실리콘 젤의 장점: 실리콘 젤은 탄성적인 특성 덕분에 접촉 상태를 안정적으로 유지합니다. 렌즈를 샘플에서 멀리 이동시켰다가 다시 원래 Z 좌표로 복귀해도 즉시 고해상도 이미지를 재현할 수 있습니다. 이를 통해 보다 유연한 초점 조정과 높은 재현성을 갖는 이미징이 가능합니다(그림 2 참조).

2. 원활한 렌즈 전환: 세척이 필요 없는 워크플로

일반적인 관찰 과정에서는 고해상도 관찰 후 저배율 공기 대물렌즈로 다시 전환하는 경우가 많습니다.

• 실리콘 오일의 한계: 실리콘 오일은 이미징 접시 바닥에 잔여물을 남깁니다. 이미징 접시를 충분히 세척하지 않은 상태에서 공기 대물렌즈로 전환하면, 잔류 오일로 인해 심각한 구면 수차가 발생하여 이미지 사용이 어려워질 수 있습니다. 또한 이러한 세척 과정은 시간이 많이 소요되며 샘플에 물리적 영향을 줄 위험이 있습니다(그림 3 참조).

• 실리콘 젤의 장점: 실리콘 젤은 이동성이 없으며 접시에 액체 잔여물을 남기지 않습니다. 검증 결과, 젤 대물렌즈에서 공기 대물렌즈로 전환하더라도 이미지 품질 저하 없이 즉시 관찰을 이어갈 수 있었습니다. 이를 통해 건식 대물렌즈의 편의성과 침지 이미징의 광학 성능을 동시에 확보한 매끄러운 워크플로를 구현할 수 있습니다(그림 4 참조).

3. 자동화 멀티웰 이미징: 스티칭 안정성 확보

고처리량 연구에서는 멀티웰 플레이트에 배치된 여러 오가노이드를 대상으로 이미지 스티칭 및 3D 이미징이 요구되는 경우가 많습니다.

• 실리콘 오일의 한계: 웰 간 이동 시 스테이지를 이동하면 실리콘 오일이 분리되거나 소실되는 경우가 빈번하며, 이로 인해 자동화 이미징이 중단되는 문제가 발생합니다. 실제 테스트에서도 실리콘 오일 대물렌즈는 첫 번째 웰 이후에는 접촉을 유지하지 못했습니다(그림 5 참조).

• 실리콘 젤의 장점: 실리콘 젤 침지 대물렌즈는 접촉 손실 없이 멀티웰 전 영역에서 모든 타겟 오가노이드를 안정적으로 이미징하는 데 성공했습니다(그림 6 참조).

오가노이드 연구의 새로운 기준

검증 결과, LUPLAPO25XS 실리콘 젤 침지 대물렌즈는 공기 대물렌즈의 사용 편의성과 침지 대물렌즈의 광학 성능을 모두 충족하는 솔루션임이 확인되었습니다.

FV5000 공초점 레이저 주사 현미경과 결합할 경우, 이 광학 기술은 오가노이드 이미징에서 발생하는 오일 접촉 손실, 관찰 간 세척 과정, 자동화 이미징 중단 등 다양한 문제를 효과적으로 해결합니다.

결과: 연구자는 대물렌즈 관리에 소요되는 시간을 줄이고 실험 자체에 더욱 집중할 수 있습니다.

고해상도와 높은 재현성을 유지하면서 오가노이드 이미징을 보다 효율적으로 수행할 수 있는 실리콘 젤 침지 기술의 가능성을확인해보세요.. 자세한 정보 확인 및 데모 요청은 Evident 팀에 문의하십시오.