자동 구면수차 보정으로 고해상도, 고대비 형광 이미징 수행

서론

형광 현미경은 세포 및 기타 생물학적 샘플의 형태적 관찰과 정량 분석을 위해 생명 과학 및 의료 연구에 널리 사용됩니다. 생물 현미경용 대물렌즈는 일반적으로 0.17mm 두께의 표준 커버 유리가 표본과 가깝게 닿는다는 가정에 따라 설계됩니다.

그러나 개구수(NA)가 높은 대물렌즈를 사용할 경우, 커버 유리 두께가 달라지거나 샘플을 깊숙이 배치하는 등 약간의 차이만 발생해도 구면수차를 유발하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 이처럼 개구수가 높은 대물렌즈 중 다수는 보정 링이라고도 알려진 보정환이 장착되어 있어 커버 유리 두께에 따라 구면수차에 맞게 조정할 수 있습니다. 최적의 이미지 품질을 달성하려면 대물렌즈 보정환 조정이 필수적입니다.

Evident의 IXplore™ IX85 도립 현미경 플랫폼은 직관적 소프트웨어와 전동식 보정환을 통해 이 프로세스를 자동화합니다. cellSens™ 소프트웨어의 버튼을 클릭하면 플랫폼은 전기 보정 링 제어 메커니즘을 사용하여 개구수가 높은 다양한 대물렌즈에 맞게 자동으로 보정환을 조정합니다. 이 자동 대물렌즈 보정 시스템을 사용하면 구면수차가 감소한 선명한 고해상도, 고대비 이미지를 효율적으로 획득할 수 있습니다.

구면수차 보정의 어려움

0.17mm의 표준 설계를 벗어난 커버 유리 두께를 사용하면 대물렌즈를 통과하는 중심 광선과 주변 광선이 동일한 초점에 수렴하지 않아 해상도와 대비가 저하됩니다. 이러한 현상을 구면수차라고 부르며, 구면수차는 보정환을 돌려 광선의 초점 위치를 정렬함으로써 보정할 수 있습니다(그림 2).

이 프로세스에는 몇 가지 어려움이 있습니다. 첫째, 이미지가 가장 선명해지는 위치를 찾으려면 반드시 보정환과 초점을 동시에 미세조정해야 합니다. 둘째, 최고의 보정 지점을 결정하려면 조금씩 선명도가 향상되는지 보기 위해 여러 이미지를 비교해야 하는 경우가 많습니다. 그 과정에서 링을 돌리고 초점을 조정하고 이미지 선명도를 평가하고 이 프로세스를 반복하여 최적의 보정환 위치를 찾아야 합니다. 현미경 사용자는 이러한 정밀한 조정을 수행하려면 전문 지식을 갖춰야 합니다. 따라서 실험 간 높은 재현성을 달성하기가 어렵습니다.

수동 조정은 또한 시간이 많이 소요됩니다. 형광 이미징 시 이 문제로 인해 장시간 노출할 경우 광표백으로 샘플이 저하될 수 있습니다. 형광 이미징에서는 신호 수준이 이미 낮으므로 정확한 시각화와 분석을 위해서는 신속하고 정확한 구면수차 보정을 통해 높은 대비를 유지하는 것이 필수적입니다.

자동 구면수차 보정 방법 소개

이미지 선명도는 이미지 대비 강도로 표현됩니다. 보정환 각도와 초점 위치가 변경됨에 따라 이미지 대비는 그림 3a에서처럼 비스듬한 산과 같은 형태를 형성합니다. 이 형태의 피크(그림 3b)가 구면수차가 가장 많이 보정된 상태를 나타내며, 보정환을 조정하는 일은 곧 이 피크 위치를 찾는 것과 같습니다. 보정이 불충분하여 피크에서 벗어나면(그림 3c) 초점이 올바르게 맞아도 이미지가 흐릿해집니다.

이러한 히트맵을 만들려면 일반적으로 보정환과 초점을 달리하면서 여러 이미지를 획득해야 합니다. 이러한 프로세스는 시간 소모적이고 형광 관찰 중 표본이 희미해지도록 합니다. 이는 대비 값에 영향을 끼치고 정확도를 저하시킵니다. 그러므로 희미해지는 현상을 최소화하려면 신속하고 정확한 자동 구면수차 보정이 반드시 필요합니다.

cellSens 소프트웨어를 사용하는 IXplore IX85에서 형광 관찰을 수행하는 용도로 새롭게 구현된 자동 구면수차 보정 기능은 초점 위치와 보정환 각도를 효율적으로 조정하도록 지원하는 Nelder-Mead 방법을 채택합니다.

대비 히트맵은 대물렌즈에 따라 그래디언트 및 확산이 달라집니다. 그러나 Nelder-Mead 방법은 최적화 대상 함수의 형태 기준으로 강건하며 비선형적인 경우에도 적용할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 각 대물렌즈용으로 정의된 히트맵을 조정하는 데 적합합니다.

심플렉스(simplex)라는 세 지점을 업데이트하여 최대 대비를 찾습니다. 첫 번째로, 그림 4(1)에서 볼 수 있듯이 처음 세 지점에서 대비를 구합니다. 그 다음, 대비가 가장 낮은 지점의 위치를 업데이트합니다(2). 하나 또는 두 개의 지점을 업데이트하는 프로세스를 반복하여 심플렉스 간격을 좁히고 수렴 기준 아래에 오면 찾기 작업을 종료합니다((3)~(10) 참조). 한 번에 전체 영역을 탐색하는 대신 검색 범위를 조정해 가며 좁히는 이 방법을 통해 불필요한 이미징 단계를 없애고 효율적으로 최고 대비 지점에 접근할 수 있습니다.

Nelder-Mead 방법은 최대 대비를 찾기 위해 전체 범위를 검색할 때에 비해 검색 범위를 신속하게 조정할 수 있다는 장점이 있습니다. UPLXAPO40X 대물렌즈를 사용하여 200밀리초의 카메라 노출 시간으로 테스트 조건을 설정했을 때 Nelder-Mead 방법은 대략 20초가 소요됩니다. 이와 대조적으로, 일반적인 전체 범위 검사 방법은 최고 대비 지점을 찾는 데 약 45초가 소요됩니다. 이 방법은 보정환 각도 θ를 10개의 부분으로, Z를 10개의 부분으로 나누어 100개의 지점을 포괄적으로 살펴보기 때문에 시간이 더 오래 걸립니다. 이와 같이 비교했을 때 자동 방법은 조정 시간을 50% 이상 단축하는 것을 알 수 있습니다.

요약

IXplore IX85 플랫폼의 전동식 보정환과 자동 조정 알고리즘은 보통 수동으로 수행하기가 어려운 구면수차 보정을 정밀하고 빠르게 수행하도록 지원합니다. 또한 자동 구면수차 보정은 빠르고 정밀한 조정을 통해 형광 현미경 검사 시 광표백을 최소화합니다. 이 보정환은 IX85 시스템에 매끄럽게 통합되어 있고 cellSens 소프트웨어를 통해 쉽게 제어 가능하며 Evident의 다양한 표준 대물렌즈와 호환됩니다. 이러한 혁신 덕분에 다양한 숙련도의 사용자가 고해상도, 고대비로 선명한 형광 이미지를 획득할 수 있습니다.