TruResolution™를 이용한 고해상도 심층 조직 이미징용 자동 구면 수차 보정

최근 몇 년 동안, 생명과학 분야의 현미경 기술은 빠르게 발전했으며, 심층 조직 구조의 고해상도 이미징에 대한 수요가 점점 증가하고 있습니다. 하지만 심층 촬영은 종종 광학 수차, 특히 구면수차의 영향을 받아 이미지 품질이 크게 저하될 수 있습니다. 따라서 이러한 수차를 정밀하게 보정하는 것이 필수적입니다.

본 백서는 FLUOVIEW™ FV5000 공초점 현미경과 FV5000MPE 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경에서 TruResolution™ 자동 구면 수차 보정 시스템이 가져오는 기술 혁신과 이점을 상세히 소개합니다. 본 논의에서는 TruResolution 시스템이 자동화와 지능형 최적화를 통해 기존 구면 수차 보정에서의 일반적인 문제점을 어떻게 해결하는지 강조합니다.

수동 구면 수차 보정 및 그 과제 개요

대물렌즈는 여러 렌즈 요소로 구성되며, 세포나 세포 소기관과 같은 미세 구조를 높은 정확도로 관찰할 수 있도록 정밀한 설계와 공학적 공정을 통해 제작됩니다. 이 렌즈들은 수차(영상 형성상의 오류)를 억제하도록 설계되어, 이상적인 조건에서 시료의 이미지를 매우 선명하게 관찰할 수 있습니다.

그러나 시료나 커버글라스와 같은 매질의 굴절률이 침지액의 굴절률과 다를 경우, 빛의 굴절로 인해 대물렌즈 중심을 통과하는 광선과 주변을 통과하는 광선 사이에 초점 깊이 차이가 발생합니다. 이 현상은 구면 수차라고 불리며, 해상도와 형광 강도가 감소하는 원인이 됩니다.

이 수차를 보정하기 위해서는 대물렌즈에 내장된 보정 칼라를 조절하는 것이 효과적입니다. 보정 칼라를 회전시키면, 중심 광선과 주변 광선 사이의 초점 깊이 차이를 보정할 수 있어 최적의 이미징 성능을 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 수침 대물렌즈를 사용하여 물 속을 관찰할 때(그림 1a), 보정 칼라를 0으로 설정하면 최적의 이미징이 가능합니다. 반면, 조직을 커버 글라스를 통해 관찰할 때(그림 1b), 교정 칼라가 조정되지 않으면 구면수차가 발생하여 초점점이 퍼지고 해상도와 형광 강도가 감소합니다. 보정 칼라를 적절히 조절하면(그림 1c), 이 수차를 효과적으로 보정할 수 있습니다.

그러나 레이저 스캐닝 현미경에서는 관찰이 일반적으로 암실 환경에서 이루어지므로, 이미지 획득 중에 보정 칼라를 수동으로 조절하기가 어렵습니다. 게다가 보정 칼라를 조절하면 초점 위치가 변경되므로, 최적 설정을 얻기 위해서는 경험과 숙련도가 필요합니다.

또한, 심층 조직 이미징에서는 표면 근처에서 보정 칼라를 조절하더라도, 관찰 깊이가 증가하면 구면 수차가 다시 발생합니다(그림 1d). 따라서 Z-스택 이미지를 획득할 때, 모든 깊이에서 최적의 보정 값을 설정하는 것은 매우 어렵습니다.

Figure 1: Schematic figures of spherical aberration caused by cover glass or tissue and the effect of correction collar adjustment.

^{그림 1. 커버글라스나 조직으로 인해 발생하는 구면 수차와 보정 칼라 조절의 효과를 나타낸 개략도.}

^{a) 이상적인 조건에서의 초점. 수침 대물렌즈를 사용하여 물에 담긴 시료를 관찰할 때, 렌즈의 중심과 주변을 통과하는 광선이 모두 동일한 깊이에서 수렴하여 구면 수차가 발생하지 않습니다.}

^{b) 구면 수차 상태에서의 초점. 침지 매질로 물을 사용하고 커버글라스를 통해 조직을 관찰할 때, 유리 경계면에서의 굴절로 인해 중심 광선과 주변 광선 사이에 초점 깊이 차이가 발생하며, 이로 인해 구면 수차가 생깁니다.}

^{c) 구면 수차 보정 후의 초점. 보정 칼라를 적절히 조절하면 중심 광선과 주변 광선 사이의 초점 깊이 차이가 보정되어 이상적인 초점 조건을 얻을 수 있습니다.}

^{d) 표면 수준에서 보정한 후 깊은 위치에서의 초점. 보정 칼라를 표면 관찰용으로 설정하고 초점면을 더 깊은 위치로 이동시키면, 구면 수차가 다시 발생하여 초점 점이 퍼지게 됩니다.}

전동식 칼라와 자동화 알고리즘을 이용한 구면 수차 보정 최적화

TruResolution 시스템은 보정 칼라를 직관적이고 정밀하게 조절할 수 있도록 하여 기존 구면 수차 보정의 문제점을 해결합니다.

첫째, 대물렌즈에 전동식 보정 칼라를 장착함으로써 사용자는 암실 환경에서도 렌즈를 직접 만지지 않고 소프트웨어를 통해 칼라를 제어할 수 있어 조작성이 크게 향상됩니다. 또한, 이 시스템에는 교정 칼라의 회전 각도에 따라 대물렌즈의 Z 위치를 자동으로 조정하는 메커니즘이 포함되어 있습니다. 이로써 보정 칼라 조절 중에도 초점 위치가 안정적으로 유지되어 항상 정확한 초점을 확보할 수 있습니다(그림 2a).

또한 TruResolution 시스템에는 최적의 보정 칼라 위치를 자동으로 결정하는 지능형 알고리즘이 포함되어 있습니다. 여러 교정 칼라 설정에서 이미지를 촬영하고 대비 곡선을 분석함으로써, 시스템은 최대 대비 지점을 찾아 이상적인 교정 값을 높은 정밀도로 계산합니다(그림 2b). 이를 통해 사용자는 소프트웨어 인터페이스에서 단 한 번의 클릭으로 최적의 보정을 적용할 수 있습니다.

Z-스택 이미지 획득 시, 사용자는 각 깊이에 맞는 적절한 칼라 위치를 미리 등록할 수 있습니다. 이후 교정 칼라는 촬영 중 자동으로 회전하여 모든 초점면에서 최적의 이미지 품질을 보장합니다. TruResolution 시스템을 통해 이제 심층 조직
Z-스택 이미징에서 정밀한 구면 수차 보정이 가능해져, 모든 깊이에서 일관되게 밝고 고해상도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

Figure 2: Change of focal plane by rotating correction collar. In case of conventional objective lens, focal plane changes by rotating the correction collar.

Figure 2: Finding optimum correction collar angle θopt.

^{그림 2.} ^{TruResolution 시스템에서 보정 칼라 제어 및 최적화 알고리즘의 개략도.}

^{a) 기존 대물렌즈 칼라를 회전시키면 초점면도 함께 변경됨(왼쪽). TruResolution 대물렌즈는 회전 각도에 따라 대물렌즈의 Z 위치를 자동으로 변경하여 초점면을 유지합니다(오른쪽).}
^{b) 최적 보정 칼라 각도(θopt) 찾기: 대조 곡선은 서로 다른 보정 칼라 각도에서 획득한 각 이미지의 대조 값을 계산하여 결정됩니다. 최적의 보정 칼라 위치는 이 대비 곡선의 최고점을 구함으로써 계산됩니다.}

다광자 현미경에서 TruResolution 시스템을 이용한 심층 조직 촬영

TruResolution 시스템은 이전에는 어려웠던 심층 Z-스택 촬영 시 교정 링의 정밀 조정을 가능하게 했습니다. 그 결과, 모든 깊이에서 밝고 고해상도 이미지를 안정적으로 얻을 수 있게 되었습니다.

이는 공초점 핀홀이나 카메라가 없기 때문에 해상도가 여기점 크기에 크게 의존하는 다광자 여기 현미경에서 특히 효과적입니다. 심층 조직 촬영에서는 빛의 산란으로 인해 형광 신호가 약해지는 경향이 있습니다. 하지만 작은 여기점 크기를 유지하면 여기 밀도가 증가하여 신호 손실을 보상하는 데 도움이 됩니다. 따라서 구면수차 보정은 해상도와 형광 강도 모두에 매우 중요합니다.

그림 3은 쥐 뇌 조직의 굴절률과 산란 특성을 시뮬레이션한 젤에 포함된 형광 비드를 촬영한 결과를 보여줍니다. TruResolution 시스템을 사용하면 깊이가 달라져도 여기점 크기가 일정하게 유지되며, 이미지 밝기도 안정적입니다. 교정 칼라가 표면 설정에 고정된 경우, 깊이가 깊어질수록 여기점 크기가 증가하여 이미지의 밝기가 감소하게 됩니다.

Figure 3: Fluorescent micro bead(φ200nm) in gel simulating optical characteristic of live mouse brain.

^{그림 3.} ^{TruResolution 시스템이 뇌 조직과 유사한 굴절률과 산란 특성을 가진 젤에 포함된 형광 마이크로비드의 심층 촬영에 미치는 효과. 생체 마우스 뇌의 광학적 특성을 모사한 젤(굴절률: 1.36)에 직경 200 nm의 형광 미세구슬이 포함되어 있습니다. 1.36, 광 산란 계수: 43cm-1) 960nm에서 여기되었으며, 모든 이미지에 동일한 레이저 출력이 사용되었습니다.}

^{윗줄: TruResolution 시스템을 사용하여 자동 구면수차 보정을 적용하고 서로 다른 깊이에서 획득한 마이크로비드 XZ 이미지.}
^{하단 행: 서로 다른 깊이에서, 젤 표면에서 최적 촬영을 위해 초기 조정된 고정 교정 칼라를 사용하여 획득한 마이크로비드 XZ 이미지.}
^{이미지 밝기 스케일은 각 깊이에서 정규화되어 있습니다. 모든 이미지는 FV30-AC25W 대물렌즈를 사용하여 획득되었습니다.}

다음으로, 그림 4는 깊이 400 에서 쥐 뇌 신경 세포 가지를 생체 내에서 촬영한 이미지를 보여줍니다. TruResolution 시스템을 사용하면 동일한 여기 조건에서도 더 밝고 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

Figure 4: In vivo observation of neuronal dendrite in a live mouse brain (Thy1-YFP-H mouse, sensory cortex) acquired at 400 µm depth, with excitation at 960 nm.

^{그림 4. 생체 내 쥐 뇌 신경 세포 가지 촬영 (Thy1-YFP-H 마우스, 감각 피질).}
^{이미지는 400 µm 깊이에서 960 nm 여기 파장과 FV30-AC25W 대물렌즈를 사용하여 동일한 여기 강도로 획득되었습니다.}

^{상단 이미지: FV30-AC25W TruResolution 대물렌즈의 자동 구면수차 보정으로 가지돌기 가시의 선명하고 고대비 이미지를 얻을 수 있습니다.}
^{아래 이미지: 비교를 위해, 기존 교정 칼라와 마찬가지로 샘플 표면에 최적화된 교정 칼라를 사용하여 동일한 시야를 촬영했습니다.}

TruResolution 시스템은 투명화된 조직 샘플에서도 효과적입니다. 투명화된 조직 샘플에서는 사용된 시약에 따라 굴절률이 크게 달라질 수 있으며, 이는 광학적 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, XLPLN10XSVMP 대물렌즈는 굴절률 1.33에서 1.52 범위를 지원합니다. 하지만 교정 칼라가 제대로 조정되지 않으면 수차가 발생하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다.

TruResolution 시스템을 사용하면 투명화된 샘플에서도 교정 칼라를 자동으로 조정할 수 있어, 항상 밝고 고해상도 이미지를 촬영할 수 있습니다.

그림 5a는 Sca l eA2로 투명화한 쥐 뇌에서 획득한 Z-스택의 XZ 이미지를 보여주며, 약 4 mm 깊이까지 관찰되었습니다. TruResolution 시스템을 사용하면 심층 영역에서도 밝고 균일한 이미지를 얻을 수 있었습니다. 특히, 관찰 매질의 굴절률이 샘플과 일치할 경우, 교정 칼라는 단일 설정만으로도 충분합니다.

그림 5b는 깊이 2.7 mm에서 획득한 XY 이미지를 보여주며, TruResolution 시스템으로 촬영한 이미지가 고정 교정 칼라 설정으로 얻은 이미지보다 훨씬 밝고 선명함을 확인할 수 있습니다.

Figure 5: Mouse brain (Thy1-YFP-H mouse）cleared with ScaleA2.

^{그림 5.} ^{TruResolution system - 투명 처리된 생쥐 뇌 샘플용.}

^{쥐 뇌 샘플은 Sca}^l^{eA2를 사용하여 투명화되었습니다. 왼쪽 이미지는 TruResolution 시스템을 사용하여 자동 보정칼라 조정으로 획득하였으며, 오른쪽 이미지는 CUBIC 투명화 시약의 굴절률에 따라 수동으로 보정칼라를 조정하여 획득하였습니다. 여기 세기는 두 조건에서 동일했습니다. 여기 파장: 960 nm; 대물렌즈: FV30-AC10SV.}
^{a) Z-스택 획득 후 Y축을 따라 250 µm 두께 단면의 최대 강도 투영.}

^{b) Z축을 따라 2.7 mm 깊이에 있는 100 µm 두께 단면의 최대 강도 투영.}

TruResolution 시스템을 이용한 공초점 레이저 주사 현미경에서의 고해상도 촬영

공초점 레이저 주사 현미경에서는 커버 글라스 두께의 차이로 인해 구면수차가 발생할 수 있어, 고해상도 이미지를 얻기 어렵습니다. 교정 칼라가 제대로 조정되지 않으면 이미지가 흐리거나 어둡게 나타나 관찰 정확도가 크게 떨어질 수 있습니다.

IXplore™ IX85 역형 광학 현미경 플랫폼에는 모터 구동 교정 칼라 장치가 장착되어 있으며, 교정 칼라가 장착되고 역형 현미경용으로 설계된 대부분의 Evident 대물렌즈와 호환됩니다. 관찰 목적에 따라 대물렌즈를 교체함으로써 시스템은 TruResolution 시스템의 일부로 유연하게 운용될 수 있습니다.

그림 6은 RapiClear로 투명화한 쥐 뇌 절편의 Z-스택 촬영을 통해 얻은 XYZ 이미지를 보여줍니다. TruResolution 시스템을 사용할 경우 XY축과 Z축 모두의 해상도가 향상되어 이미지가 더 밝고 선명해집니다.

^{그림 6.} ^{RapiClear 2로 투명화한 쥐 뇌 절편의 공초점 이미지 촬영.}

^{0.85 µm 간격으로 LUPLAPO25XO(NA 1.0, WD 1 mm) 대물렌즈를 사용하여 27장의 Z-스택 이미지를 획득했습니다. 표시된 이미지는 XY 평면의 최대 강도 투영(MIP)과 XZ 및 YZ 평면의 단면 뷰를 포함합니다. 마젠타: DAPI로 염색된 핵. 녹색: GFP로 표지된 뉴런.}

^{a) TruResolution 시스템을 사용하여 자동 교정 칼라 조정으로 획득한 이미지.}
^{b) 교정 칼라를 가장 낮은 굴절률 방향으로 완전히 회전시켜 촬영한 이미지. 이 조건은 대물렌즈를 회전식 노즈피스에 장착하면서 교정 칼라를 고정하고 회전시키는 상황에 해당합니다.}
^{이 결과는 TruResolution 시스템의 자동 교정 칼라 조정이 더 밝고 고해상도 이미지를 획득할 수 있음을 확인시켜 줍니다.}

결론

본 백서는 TruResolution 시스템이 제공하는 자동 구면수차 보정 기술과 그 효과가 입증된 사례를 자세히 설명했습니다. 전통적으로 심층 조직 촬영이나 투명화 샘플 작업에서 교정 칼라를 조정하는 일은 매우 어렵고, 그로 인해 이미지 품질이 일정하지 않거나 조작이 복잡해지는 문제가 자주 발생했습니다.

TruResolution 시스템은 통합된 다양한 기능으로 이러한 문제를 근본적으로 해결합니다. 교정 칼라의 모터 구동 제어, 초점 위치의 자동 유지, 최적 교정 설정의 지능형 결정, 그리고 Z-스택 촬영과의 완전한 호환성.

심층 촬영에 대한 수요와 다양한 샘플 조건에 대한 적응 필요가 계속 증가함에 따라, TruResolution 시스템은 고정밀·높은 재현성의 이미징을 지원하는 핵심 기술로 자리매김하여 현미경 관찰의 가능성을 크게 확장할 것으로 기대됩니다.

저자

Hiromi Utsunomiya
생명과학 첨단 이미징, 제품 관리, Evident

감사의 글

응용 이미지는 RIKEN CBS-EVIDENT 오픈 협력 센터에서 Monai Hiromu 박사, Hirase Hajime 박사, Miyawaki Atsushi 박사의 협조로 촬영되었습니다.

참고문헌

본 백서에서 언급한 연구에 대한 자세한 내용은 다음 논문을 참조하시기 바랍니다.

1. Ue, Y., Monai, H., Higuchi, K., et al. “A Spherical Aberration-Free Microscopy System for Live Brain Imaging.” Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, Vol. 500, 236–241.

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