远程显微镜指南：确保实验室成功的6个技巧

Takeo Ogama

2020年 9月 28日

随着越来越多的实验室人员按照社交间隔要求在家工作，人们正在利用远程工作IT平台保持沟通以及确保生产力。但是，科学家和实验室人员这种工作方式的变化也意味着必须调整实验方法，以便充分利用远程平台。如果您感到无所适从，那么本篇博客或可为您提供帮助。

以下六个技巧可以帮助您成功实现远程的显微观察：

1.确定实验室存在可用的IT平台。

您的远程工作能力在很大程度上取决于实验室的IT基础设施。

在计划进行远程显微观察时，首先需要确认可以使用哪些Web会议工具或软件，您的研究所是否存在任何网络限制以及其他IT基础设施相关注意事项。

另外还要检查以确保不会发生软件造成的意外中断。例如，Windows更新可能会在夜间运行，这就需要重新启动系统，并对远程操作造成影响。尽管您必须要遵守本地IT策略，但关闭更新就能够防止发生这一问题。

2.通过探索现有远程功能设计您的显微观察。

下一步就是通过确定可以远程进行的操作以及必须现场进行的操作进行远程观察的规划和设计。

这些可能要取决于您的显微镜以及所进行的实验。使用全电动显微镜时通常设置完观察方法之后就可以离开，但还是要务必记住以下几点总则：

哪些操作要在本地进行：标本设置和聚焦，校正环调节，必要时需添加镜油以及设置远程环境
哪些操作可以远程进行：粗略设置聚焦之后的操作，对观察进行微调以及分析或共享图像

即便您的系统无法进行远程监视或操作，供应商所提供的方案也值得关注。

比如说，大多数专业显微镜均采用模块化设计，并且可以升级为电动系统。此外，如今还有很多显微观察专用工具以及用于远程监视、图像共享或显微镜操作的通用网络会议平台。

通常，我们不建议使用镜油进行远程观察，原因是这类远程操作可能很非常棘手。镜油无法进行远程添加，如果添加过多或者没有进行使用后的正确清洁，则可能会造成图像质量问题，甚至损坏您的光学系统。但有一个例外，那就是可以使用能够自动添加镜油的研究型载玻片扫描仪。对于熟悉镜油使用的人士，可以考虑预先添加镜油（在开始实验之前添加油）。

远程显微观察指南

图1.必须在现场完成的远程显微观察任务总则。注意，照明条件可以根据显微镜配置情况实现远程控制。

3.调整齐焦性。

当我们通过目镜观察时，由于在更换物镜之后很容易进行快速聚焦微调，因此很少会意识到齐焦性调整的重要性。但在进行远程显微观察时，不同倍率之间的齐焦性就成为顺利进行观察的关键因素。

在完美设置齐焦性情况下，切换倍率时就无需重新调整焦点。有关相机齐焦性调整的内容请参阅我们的快速操作指南。正如指南所述，在调整相机齐焦性之前，请先通过目镜调整齐焦性，这一点非常重要。

4.检查载物台平坦度。

载物台的平坦度无法通过远程方式解决，但如果忽视这一问题，就可能导致您的样品失焦。幸运的是检查载物台平坦度非常容易。当您人在实验室时，只需在XY方向上以高倍率移动载物台即可，此时其具有较浅的焦深（稍后说明）。

如果无法确保载物台的平坦度，则焦平面可能会相对样品Z平面发生偏移，并最终在XY移动过程中导致样品失焦。尽管某些第三方载物台插件配有调节水平的螺钉，但奥林巴斯设计的插件无需进行调节即可获得平坦的载物台。

5.依据最佳实践进行显微观察的远程聚焦。

聚焦是最具挑战性的远程操作之一，更麻烦的是，如果物镜碰撞样品并导致样品或光学器件损坏，会造成难以挽回的后果。即使标本从倒置显微镜标本夹上脱落这种小问题，远程操作也无法很好解决。

那么，如何避免这些情况呢？务必遵循以下五项远程聚焦的总则：

小心监控：说起来容易做起来难。关键问题在于预览图像的帧速率和实际Z轴移动的延迟。但可以采用几种方法对此加以改善。首先，对图像采集设置进行像素合并或二次采样是提高帧速的通常方法。您所使用的网络会议工具也可能会对帧率和延迟造成限制。某些网络会议工具提供可以调整图像质量和速度的设置菜单。我们建议速度优先，在搜索焦平面时尤其如此。
使用具有更大景深的分步操作方法：这种方法有助于避免发生每幅图像均超出景深范围而看不到任何东西的情况。如果图像散焦过大，则可能无法判断应该将焦点调高还是调低。因此，要尽量避免将注意力集中在景深以外的目标上。景深由数值孔径（NA）确定。高数值孔径物镜具有较浅的景深。因此，我们建议您按从低数值孔径到高数值孔径（通常为从低倍率到高倍率）的顺序调整聚焦。在使用共聚焦显微镜时，“更深景深”的类似模拟可以提供帮助。因为较小的共聚焦针孔会导致景深变浅，所以当找不到标本或标本太暗时，可以尝试使用较大的针孔寻找和聚焦观察对象。在精确对焦后，设置适当的共聚焦针孔大小和激光功率进行图像采集。
图2.（左）低倍物镜通常具有较低的数值孔径和较广的景深，从而可以看到更宽的Z范围。（右）具有高数值孔径的高倍率物镜景深较浅。这样有助于让您只观察聚焦的样品，但存在失焦风险。
从远到近：如上所述，碰撞到样品是应始终避免的最糟糕情况，因此，务必从远到近小心地靠近。如果使用的是倒置显微镜，则从下方开始。如果是正置显微镜，则从上方开始接近。在大幅度移动XY轴时，在移动载物台之前一定要先移动物镜。
图3.（左）对于倒置显微镜，要从下方靠近样品；（右）对于正置显微镜，要从上方靠近样品。
想象一下样品的3D形状：您的样品在不同的XY位置时可能并在同一Z平面中，并且当移动过远时，可能会导致样品失焦。这可能是样品本身或上面所说的载物台平坦度造成的。在使用景深较浅的高数值孔径物镜时，最好稍微移动XY轴并小心调整Z轴，避免在没有同时聚焦的情况下移动距离过大。在发生失焦时，如果可能可以切换到更宽的景深设置。如果想要创建拼接图像，则聚焦地图可以帮助您设置聚焦高度信息。
图4.如果标本不在同一Z平面中，那么在移动距离过大时（a），就会发生失焦。在这种情况下，我们需要重新调整聚焦（b）或尝试使用其他物镜
注意聚焦限制：为了保护样品和设备，有可能已经设置了聚焦限制。对于对此不熟悉的人员，聚焦限制功能会限制Z轴的可移动范围。通常情况下您无需更改聚焦限制。但如果有人更改了设置，或者您使用的是特别厚的样品（比如，底部较高的培养皿），那么聚焦限制功能可能会让您无法足够靠近样品进行观察。请注意，由于我们需要观察物镜和样品之间的物理距离，聚焦限制设置只能在本地操作。