介绍

显微镜是科学家推动科研进展的重要工具，而物镜是显微镜系统的关键组成部分。很多应用都需要图像兼顾大视场和高质量，但某一成像要素的改善（如平场性）就会导致其他成像要素的劣化，因此通常需要权衡取舍。由于采用革新的制造技术，奥林巴斯X Line高性能物镜能够在三个关键要素方面提供更出色的光学性能-更大的数值孔径（NA）、更好的平场性以及更宽的色差校正范围。这些关键要素的进步保证各类应用都能兼顾显微图像的高质量和大视场（FOV）。

了解奥林巴斯显微镜的历史

背景

传统物镜制造技术不得不在数值孔径、平场性和色差校正之间做出权衡取舍，从而难以在一颗物镜上同时改善这三个关键要素。过去，我们的工程师专注于设计制造在上述三个要素之一表现出色的物镜，让用户能够根据其应用选择最佳适配的物镜。这些物镜设计可在相对狭窄的区域（较小视场）捕捉高分辨率图像。由于处理算法通常假定图像不存在光学像差或周边变暗，有时候此类图像在使用图像分析软件时会出现问题。除非物镜能够在大视场范围内都提供高分辨率、高质量的图像，否则很难获得可靠、准确的处理数据。X Line物镜背后革新的先进制造技术解决了这些难题。

X Line物镜具备更出色的数值孔径、平场性和色差校正

NA为1.35的UPLSAPO60XO物镜和NA为1.42的PLAPON60XO物镜均使用传统的制造技术。为了获得较高的NA，我们降低了平场性，并将色差校正从435–1000 nm减小到435–656 nm。但是，X Line UPLXAPO60XO物镜的设计NA值为1.42，同时具有更高的平场性且色差校正范围增加到400–1000 nm。这是X Line物镜实现更高色差校正、亮度、分辨率和平场性的一个示例。

图1. 显示革新的制造技术改善X Line物镜NA、平场性和色差校正的对比结果

大视场下实现高分辨率成像的关键因素

数值孔径

物镜的数值孔径是衡量其聚光能力的指标。该参数是决定分辨率、焦深和图像亮度的重要因素。具有较大数值孔径的物镜可以汇聚更大范围的光线，从而生成更明亮、更高分辨率的图像。数值孔径对于观察非常精细的结构或在荧光观察过程中检测较弱信号也很重要。X Line物镜中，UPLXAPO40XO的数值孔径为1.40，但不会降低其他方面的光学性能（图2）。

图2. 数值孔径非常出色，但不会影响色差校正范围

图像平场性

物镜的平场性受到球差和彗差，像散像差以及像场弯曲和周边变暗影响所致清晰度不足的限制。图像平场性是定量分析大视场高分辨率观察结果数据可靠性的重要指标。我们的X Line物镜即便在较大视场观察中也能够在不影响数值孔径或色差校正的情况下提供从中心到外围的出色图像平场性。

图3. 对比传统PLAPON和X Line UPLXAPO物镜的平场性

色差校正

透镜由玻璃制成，而玻璃对每种波长的光具有不同的折射率。这种透镜无法将不同波长的光聚焦在一个点上的现象被称为色差。在显微镜观察过程中，色差校正对于获取高质量图像非常重要。UPLSAPO60XO和PLAPON60XO等传统技术制造的物镜，其色差校正范围分别为435–1000 nm和435–656 nm。由于这些范围，UPLSAPO60XO的短波长（ 656 nm）焦点位置不是共定位。相比之下，UPLXAPO60XO X Line物镜的色差校正范围为400＆＃x2013; 1000 nm，而数值孔径仍为1.42（图3和4）。

图4. 比较400–1,000 nm波长范围的焦点位置（越小越好）

图4-2. 比较荧光小球的PSF（405 nm，633 nm）的轴向色差

X Line革新的制造技术

奥林巴斯设计和制造物镜的历史已逾百年。凭借多年积累的丰富专业知识，我们开发出一种新颖的专有透镜抛光技术。这项技术让我们能够制造具有超薄边缘的凸透镜以及超薄的凹透镜。透镜形状让其能够捕捉比传统透镜更大角度的光线。由于其非常薄，因此每个物镜壳体内可以容纳更多透镜，我们因此能够增加数值孔径、平场性和色差校正范围。

显微镜物镜由多个凸透镜和凹透镜组成，用于校正不同的折射率和各种光学像差。这些透镜经过组合达到国际标准的45mm长度。我们可以使用一个简单的凹凸三透镜系统模型作为示例，了解在X Line物镜上实现的改进。这些改进包括增加数值孔径、图像平场性和宽波长范围的色差校正（图5z。3个透镜的合成焦距（f）由以下公式定义。合成焦距为确定物镜放大倍率的常数。

数值孔径的扩展：适用于高分辨率和高信噪比

为了设计具有高数值孔径（NA）的物镜，需要更宽的角度收集光线，h1应该更高。此外，通过公式h3 ＝ NA×f，高数值孔径与高h3（光瞳半径）系数相关联。为了获得较高的h1和h3，则应增加透镜的有效直径。为了在保持物镜全长（45mm）的同时提高数值孔径，必须让凸透镜的边缘（透镜外周厚度）t（图5-2（a））极薄。（图5-2（b））

图5-2. 超薄边缘凸透镜的效果

更好的图像平场性：采集和观察到视场内均匀清晰的图像

为了设计具有更好图像平场性（IF）的物镜，需要较小的佩兹伐和（P）。佩兹伐和（P）定义如下。

凸透镜的正（+）因子表示凸透镜让图像弯曲，从而图像外围部分更接近标本，如下图所示。与凸透镜相比，凹透镜则让图像弯曲的方向相反，作为负（－）因子使用。

图5-3. 通过凸透镜和凹透镜的场曲率

由于显微镜物镜作为凸透镜使用，因此（P）中的正（+）因子大于负（-）因子。因此，为了提高IF且确保P的绝对值较小，需要较大的负（－）因子（图5-4）。

图5-4. 佩兹伐和与场曲（平坦度）校正之间的关系

要创建一个较小的P值，应同时降低f2和h2系数，这是因为h3变为用以控制物镜倍率（合成焦距f）和数值孔径的常数。可以通过增加凸透镜和凹透镜之间的距离降低系数h2，但是在有限空间中，需要具有较小（d）的薄中心凹透镜。（图5-5）

图5-5. 超薄凹透镜的效果

扩展色差校正波长范围：更清晰、更准确的信息采集

色差是由于玻璃对不同波长具有不同折射率所导致的。通常对于较短的波长，玻璃的折射率较高。因此在凸透镜中，短波长的光线聚焦在距透镜较近的位置，长波长的光线聚焦在距透镜较远的位置。凹透镜可散射较短波长的光线。因此，通过组合凸透镜和凹透镜可以进行色差校正（CC），让红光和蓝光聚焦在同一位置（图5-6）。

图5-6. 单透镜和复合透镜的色差比较

为了获得大范围的色差校正，需要多个由2或3片透镜组成的胶合透镜。此外，薄透镜是在有限空间内使用的关键组件。
传统设计采用7组13片透镜，其性能如左图（C）所示。9组15片透镜的超薄透镜设计则可以大幅度提高性能，如右图（d）所示。 （图5-7）。

图5-7. 传统设计与超薄透镜设计的对比

如上所述，X Line物镜通过采用超薄透镜设计可同时将物镜总长度保持在与现有显微镜兼容的45 mm国际标准 。设计和制造方面的改进最终打造出具有高数值孔径、更好图像平场性和宽波长范围色差校正的X Line物镜。

通过波前像差控制获得稳定的质量

X Line高性能物镜的制造工艺对生产线的波动非常敏感，因此在组装过程中采用先进的波前像差控制确保不同物镜的一致性。（图6a和6b）。

图6. 波前像差控制

创新成像

更出色的图像平场性可以改善全玻片成像（WSI）

与传统物镜相比，X Line物镜更好的图像平场性对于全玻片成像应用非常有益。作为X Line物镜之一的UPLXAPO20X数值孔径为0.80，与传统物镜（图7a）相比，其整个视场的图像平场性获得显著改善（图7b），并且分辨率得到提升。这些改进可让每个图像获得更好的图像质量，并且能够进行更高效的拼接图像采集。

图7. 使用传统（7a）和X Line物镜（7b）采集的图像

X Line物镜数值孔径的改进也有助于进行荧光成像。数值孔径的增加让照明样品所需的光子可以更少，因此减少了荧光观察过程中的光毒性和光漂白。图像在整个视场中始终保持明亮，从而可以进行更准确的分析。

图8. 比较荧光观察中的物镜亮度

使用高数值孔径获得可靠的多色荧光图像

在400–1000 nm范围内具有更好色差校正的X Line物镜能够提供准确的多色荧光观察数据

多种波长范围内的色差校正可以获得准确的定量结果

数字技术的进步让大视场的定性分析和成像非常常见。高质量的原始数据对于确保分析可靠性至关重要。图10显示为使用不同物镜采集并使用分析软件进行细胞核的分析和自动识别的DAPI（405 nm激发波长）染色核荧光图像。在传统物镜获得的图像中，由于405 nm激发波长在色差校正范围之外，并且图像平坦度较差，因此无法精确识别外围的核（图10a）。但是由于X Line物镜的色差校正在405 nm波长获得改进，使用X Line物镜（UPLXAPO60XO; NA 1.42）甚至可以准确识别外围的核（图10b）。

图10.405 nm波长处的图像比较（左：原始图像，右：分析结果）

NA为1.4的X Line UPLXAPO40XO物镜兼顾三个重要因素，能够让实验更具效率

传统40X物镜具有较大的视场，适合观察多个细胞。因此，用户通常使用40X物镜搜索感兴趣区域，然后切换到更高数值孔径物镜（如60X或100X物镜）获取高分辨率图像。

UPLXAPO40XO X Line物镜的数值孔径为1.40，与传统60X或100X物镜的数值孔径相同。这让用户能够仅使用40X物镜就可在大视场上捕捉高分辨率的图像，如图11所示。无需更换物镜或添加油，并且将失去样品位置的风险降到最低。

图11.UPLXAPO40XO X Line物镜（NA 1.40）

高分辨率多色拼接图像，其中包括405 nm激发

为了获得大标本（如组织切片）的完整图像，通常会捕捉许多小图像，然后将其拼接在一起构成大尺寸图像。拼接图像的质量取决于图像的平场性。图像平场性越好，图像拼接越无缝。即便在405激发的条件下，UPLXAPO60XO X Line物镜也能获得出色的图像平场性和宽波长范围的色差校正，创建高质量的拼接图像（图12）。

图12. 比较拼接图像（12×12）

<sub>Fucci2 Tg小鼠脑部切片
使用60倍油浸物镜（NA1.42）通过FV3000捕捉12X12图像的拼接图像
青色：DAPI（405nm）
洋红色：mCherry ‘561nm)

图像数据由RIKEN脑科学中心细胞功能动力学实验室提供
Takako Kogure, Atsushi Miyawaki</sub>

世界首个^{* 2} NA 1.50平场复消色差物镜

通过先进的透镜抛光技术，实现革新的技术进步，获得世界首个数值孔径为1.50的平场复消色差物镜。这类高分辨率物镜特别适合超分辨率或TIRF成像。

图13. 高分辨率图像比较

*2 截至2018年10月4日。根据奥林巴斯对使用普通油浸（折射率ne = 1.518）物镜的研究。

总结

高质量物镜与（计算和设备方面）数字技术的结合正在变得日益重要。得益于革命性的透镜抛光技术，奥林巴斯X Line高性能物镜不但可以改善数值孔径、图像平场性和色差校正，还可帮助获得可靠的定量和定性成像效果。

X Line和高分辨率物镜

适用于产品特性

作者
Masahiro Sakakura
研发组
光学系统开发部
Olympus Corporation

*1 虽然它已经成为医学研究中最重要的细胞系之一，但我们必须认识到Henrietta Lacks对科学的贡献是在未经她同意的情况下发生的。这一不公正现象在导致免疫学、传染病和癌症方面重大发现的同时，也引发了关于医学中的隐私、伦理和同意方面的重要对话。
要了解更多关于Henrietta Lacks的生平和她对现代医学的贡献，请点击这里。
http://henriettalacksfoundation.org/