Die Reproduzierbarkeit in der konfokalen Mikroskopie hängt von mehr als nur der Probenvorbereitung und der Technik des Anwenders ab. Die Geräteleistung, die Stabilität der Beleuchtung, die Detektionsempfindlichkeit, die Aufnahmeeinstellungen und die Erfassung von Metadaten können von Sitzung zu Sitzung variieren.

Diese Variablen lassen sich besonders schwer in gemeinsam genutzten Bildgebungszentren kontrollieren, in denen mehrere Forscher mit unterschiedlichem Erfahrungsniveau dasselbe Gerät verwenden. Ein konsistenterer Ansatz zur „ “ beginnt damit, zu ermitteln, welche Bedingungen sich ändern können, und deren Messung und Steuerung näher an das Gerät heranzurücken.

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Warum Reproduzierbarkeit in gemeinsam genutzten Bildgebungszentren schwierig ist

Reproduzierbarkeit ist in gemeinsam genutzten Bildgebungszentren schwierig, da unterschiedliche Nutzer, sich ändernde Gerätebedingungen und unvollständige Metadaten das endgültige Bild beeinflussen können. Das Personal der Einrichtung muss Forscher mit unterschiedlichem Erfahrungsniveau unterstützen, kann jedoch nicht jede Einstellungsentscheidung beobachten oder jede Aufnahmebedingung in Echtzeit überprüfen.

Eine britische Studie aus dem Jahr 2022, die in dem zum Download bereitgestellten Whitepaper zitiert wird, stellte große Unterschiede im Management von Kernlaboreinrichtungen fest, wobei dasselbe zweiköpfige Personal für 20 bis 280 Nutzer verantwortlich war. Dies erschwert die manuelle Überwachung, insbesondere wenn Abweichungen möglicherweise erst dann erkennbar werden, wenn Bilder über verschiedene Sitzungen, Nutzer oder Probenchargen hinweg verglichen werden.

Die Herausforderung bei der Dokumentation ist ebenso groß. Eine ebenfalls in dem Whitepaper erwähnte Auswertung von 240 Forschungsartikeln aus dem Jahr 2020 ergab, dass nur 17,7 % der Veröffentlichungen zur Fluoreszenzmikroskopie die Mindeststandards für die Angabe von Aufnahmeparametern und Gerätemetadaten erfüllten. Wichtige Details können daher in den veröffentlichten Aufzeichnungen fehlen, selbst wenn die resultierenden Bilder für die Analyse geeignet erscheinen.

Reproduzierbarkeit beginnt bereits vor der Aufnahme des ersten Bildes. Sie hängt davon ab, ob das System die Bedingungen, die das Bild prägen, messen und steuern kann, anstatt sich vollständig auf das Gedächtnis, die Schulung und die manuelle Dokumentation des Anwenders zu verlassen.

Warum Laserleistung und Softwareeinstellungen nicht ausreichen

Software-Prozentangaben beschreiben eine ausgewählte Einstellung, nicht unbedingt die Menge der an die Probe abgegebenen Laserleistung. Ein Sitzungsprotokoll, das eine Lasereinstellung von 10 % aufzeichnet, dokumentiert zwar eine Drehknopfposition, bestätigt jedoch nicht, wie viel Licht während der Aufnahme die Probe erreicht hat.

Eine Studie, die in dem als Whitepaper zum Download verfügbaren Dokument zitiert wird, beschrieb Schwankungen der Laserleistung um das bis zu 50-Fache bei konfokalen Systemen desselben Anbieters. Laut demselben Bericht schwanken Festkörperlaser innerhalb einer einzigen dreistündigen Sitzung üblicherweise um 25 % bis 50 %.

Dieselbe Softwareeinstellung kann daher je nach Gerät oder Sitzung unterschiedliche Beleuchtungsbedingungen bedeuten. Für die quantitative Bildgebung reicht ein aufgezeichneter Prozentsatz nicht aus, um einen Intensitätsunterschied zu erklären. Die relevante Frage ist nicht nur, welche Einstellung der Anwender gewählt hat, sondern welche Leistung das Gerät zum Zeitpunkt der Aufnahme tatsächlich erbracht hat.

Diese Unterscheidung ist der Ausgangspunkt für die Reproduzierbarkeit auf Geräteebene: die Trennung des Softwarebefehls von der gemessenen Leistung des Geräts.

Warum die Reproduzierbarkeit auf die Geräteebene verlagert werden muss

Die Reproduzierbarkeit sollte auf die Geräteebene verlagert werden, da gemeinsame Einrichtungen sich nicht allein auf die Schulung der Benutzer und manuelle Überwachung verlassen können, um alle Bedingungen zu kontrollieren, die ein Bild beeinflussen. Die routinemäßige Wartung der Mikroskope und Kontrollen zur Überprüfung, ob das System innerhalb der erwarteten Parameter arbeitet, stellen zudem eine erhebliche zeitliche Belastung für das Personal der Einrichtung dar.

Die Qualitätskontrolle auf Geräteebene kann verschiedene Teile des Bildgebungsprozesses unterstützen:

• Beleuchtung: Ein System zur Überwachung der Laserleistung kann die Laserleistung anhand eines Installations-Referenzwerts messen und Korrekturen unterstützen, wenn sich die abgegebene Leistung ändert.
• Geräteleistung: Ein System zur Überwachung der Mikroskopleistung kann die Laserleistung, die Detektionsempfindlichkeit und die Bildgebungsleistung in festgelegten Intervallen bewerten.
• Detektion: Eine photonenauflösende Detektion kann eine zuverlässigere Grundlage für den Vergleich der Intensität über verschiedene Sitzungen hinweg bieten, wenn die optische Konfiguration konsistent bleibt.
• Einrichtung des Arbeitsablaufs: Automatisierte Tools können dazu beitragen, die Probenpositionierung, den Fokus, die Anpassung der Laserleistung und die Starteinstellungen für wechselnde Benutzer zu standardisieren.

Abweichungen, die auf einer dieser Ebenen auftreten, können sich auf die resultierenden Daten auswirken, selbst wenn die anderen Bedingungen gut kontrolliert werden. Zusammen können diese Funktionen Aufnahmebedingungen gewährleisten, die über verschiedene Sitzungen und Benutzer hinweg auf demselben System vergleichbar bleiben.

Wie unterstützt das FLUOVIEW™ FV5000 eine reproduzierbare Bildgebung?

Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop Evident FLUOVIEW™ FV5000 unterstützt die reproduzierbare Bildgebung durch Photonenzählung, Laserdriftkorrektur, planmäßige Leistungsüberwachung und automatisierte Workflow-Tools in kompatiblen Konfigurationen.

Seine SilVIR™-Detektoren ermöglichen eine Quantifizierung auf Photonenebene, während der Laser Power Monitor dazu beiträgt, eine gleichbleibende Laserleistung über mehrere Sitzungen hinweg aufrechtzuerhalten. Der Microscope Performance Monitor bewertet die Systemempfindlichkeit und die Konsistenz der Bildgebung und hilft dem Laborpersonal, Veränderungen in der Geräteleistung innerhalb weniger Minuten zu erkennen. Die FLUOVIEW Smart™-Software bietet automatisierte Tools, die dazu beitragen können, die routinemäßige Einrichtung für Anwender mit unterschiedlichem Erfahrungsniveau zu vereinfachen.

Erfahren Sie mehr über die FLUOVIEW Smart-Software und ihren Ansatz für intuitive, KI-gestützte konfokale Arbeitsabläufe.

Um genauer zu erfahren, wie SilVIR die quantitative konfokale Bildgebung unterstützt, lesen Sie das Whitepaper: SilVIR-Detektorsystem der nächsten Generation für das konfokale Lasermikroskop FLUOVIEW FV5000.

Schaffen Sie eine solidere Grundlage für die Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit der konfokalen Bildgebung hängt von der Kontrolle der Bedingungen ab, die ein Bild prägen – und nicht nur von der Überprüfung des Bildes nach der Aufnahme. Laserleistung, Detektorverhalten, optische Leistung, Einstellungsentscheidungen und Metadaten tragen alle zu den mit einem Experiment verbundenen Aufzeichnungen bei.

Durch Automatisierung auf Geräteebene können Kalibrierung, Leistungsüberwachung, Aufnahmeeinstellungen und Berichterstellung in den Basis-Workflow integriert werden. In gemeinsam genutzten Bildgebungszentren kann dieser Ansatz Forschern helfen, über verschiedene Sitzungen hinweg mit größerer Sicherheit zu arbeiten, während er den Leitern der Einrichtungen klarere Anhaltspunkte liefert, wann ein Bild oder ein Experiment einer Überprüfung bedarf.

Laden Sie das Whitepaper „Sichern Sie die Reproduzierbarkeit der Konfokalmikroskopie, bevor Anwender das Mikroskop bedienen“ herunter, um zu erfahren, wie diese Ebenen zusammenwirken, und um Ihre Einrichtung anhand der acht Punkte umfassenden Checkliste zur Betriebsbereitschaft zu bewerten.