Organoide, die menschliche Organe nachahmen, gewinnen in der Wirkstoffforschung und der Entwicklung von Krankheitsmodellen zunehmend an Bedeutung. Ihre beträchtliche Dicke und Größe stellen jedoch besondere Herausforderungen für die Mikroskopie dar.

Typischerweise verwenden Forschende einen Arbeitsablauf, der zwischen niedriger Vergrößerung zur Orientierung und hoher Vergrößerung für Details wechselt oder Bild-Stitching einsetzt, um das gesamte Präparat zu erfassen. Standardmäßige Luft- (Trocken-)Objektive sind zwar praktisch, aber bei der Bildgebung tiefer im Organoid stoßen sie oft an ihre Grenzen in Bezug auf Auflösung und Arbeitsabstand.

Um hochauflösende 3D-Bildgebung zu erreichen, sind konfokale Mikroskope in Kombination mit Immersionsobjektiven (Wasser, Öl oder Silikonöl) der Goldstandard. Dennoch bringen diese Ansätze praktische Herausforderungen mit sich: Immersionsfilm kann während der Bewegung des Tisches reißen, und verbleibendes Immersionsmedium auf der Schale bzw. Objektträger kann die Bildqualität verschlechtern, wenn zu Luftobjektiven zurückgewechselt wird.

In diesem Beitrag stellen wir eine wegweisende Lösung vor: ein neuartiges Silikongel-Immersionsobjektiv (LUPLAPO25XS) in Kombination mit dem FLUOVIEW™ FV5000 Konfokal-Laserscanning-Mikroskop zur Bildgebung von Hirnorganoiden. Wir untersuchen die drei Hauptvorteile dieser optischen Technologie gegenüber der Verwendung herkömmlicher Silikonöl-Immersionsobjektive.

Protokoll für das Organoid-Bildgebungs-Experiment

Um die Vorteile der Silikongel-Immersion zu evaluieren, verwendeten wir das Organoid, das anhand des folgenden Protokolls hergestellt wurde:

Generierung zerebraler Organoide
Human induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs; Linie 201B7) wurden unter undifferenzierten Bedingungen im eTeSR Medium (STEMCELL Technologies) gehalten. Zerebrale Organoide wurden mit dem STEMdiff Cerebral Organoid Kit (STEMCELL Technologies) erzeugt. Der Differenzierungsprozess, einschließlich der Bildung von Embryoidkörpern, der Induktion des Neuroektoderms und der anschließenden Organoidreifung, wurde gemäß den Anweisungen des STEMdiff Cerebral Organoid Kits durchgeführt.

Immunfärbung und Gewebeklärung
Organoide wurden fixiert und einer Immunfärbung unterzogen, wobei DAPI zur Kernmarkierung, Anti-TUJ1 (Alexa Fluor 488) für neuronale Marker und Anti-PAX6 (Alexa Fluor 594) für neuronale Vorläufermarker eingesetzt wurden. Nach der Färbung wurden die Proben mit dem Sca l eS4-Gewebeklärungsreagenz vor der Bildgebung geklärt.

Drei Vorteile der Silikongel-Immersion bei der Bildgebung von Hirnorganoiden

Das Experiment belegte, wie das Silikon-Gel-Immersionsobjektiv LUPLAPO25XS in Verbindung mit dem Konfokalmikroskop FV5000 gängige Probleme bei der Bildgebung von Gehirnorganoiden erfolgreich löste. Hier sind die drei wichtigsten Vorteile:

1. Z-Achsen-Stabilität: Kein Kontaktverlust

Bei konventioneller Silikonölimmersion ist ein kontinuierlicher Flüssigkeitsfilm zwischen dem Objektiv und der Schale notwendig. Bei tiefen Z-Stapel-Bildgebungen oder größeren Fokus-Anpassungen kann dieser Film leicht reißen.

• Die Silikonöl-Herausforderung: Sobald der Kontakt mit dem Silikonöl verloren geht, führt die Rückkehr zur ursprünglichen Z-Koordinate häufig zu einem verschwommenen Bild, da das Öl nicht automatisch einen perfekten Meniskus neu bildet. Forschende müssen manuell eingreifen, um das Öl erneut aufzutragen oder das Objektiv anzupassen, wodurch das Experiment unterbrochen wird (Abbildung 1).
• Vorteile des Silikongels: Dank der elastischen Eigenschaften des Silikongels ist der Kontakt widerstandsfähig. Selbst wenn das Objektiv weit von der Petrischale entfernt wird, wird durch die Rückkehr zur Ziel-Z-Koordinate sofort ein hochauflösendes Bild wiederhergestellt. Dadurch sind flexiblere Fokusanpassungen und hochgradig reproduzierbare Bildaufnahmen möglich (Abbildung 2).

2. Nahtloser Objektivwechsel: Ein Workflow ohne Reinigung

In einem typischen Beobachtungsworkflow wechseln Forschende nach einer hochauflösenden Untersuchung oft wieder zurück zu einem Luftobjektiv mit geringer Vergrößerung.

• Die Silikonöl-Herausforderung: Silikonöl hinterlässt Rückstände am Boden der Schale. Wenn man auf ein Luftobjektiv umschaltet, ohne die Schale vorher gründlich zu reinigen, kann das verbliebene Öl zu starker sphärischer Aberration führen, wodurch das Bild unbrauchbar wird. Dieser Reinigungsprozess ist zeitaufwändig und birgt das Risiko, die Probe zu verschieben (Abbildung 3).
• Vorteile des Silikongels: Silikongel wandert nicht und hinterlässt keine flüssigen Rückstände auf der Schale. Unsere Überprüfung ergab, dass man vom Gel-Objektiv auf ein Luft-Objektiv wechseln und die Beobachtung unmittelbar ohne jegliche Bildverschlechterung fortsetzen kann. Dies ermöglicht einen nahtlosen Arbeitsablauf, der den Komfort von Trockenobjektiven mit der optischen Leistung der Immersionsbildgebung kombiniert (Abbildung 4).

3. Automatisierter Multiwell-Erfolg: Stabilität beim Stitching von Bildern

High-Content-Screening erfordert häufig das Zusammenfügen von Bildern und die 3D-Bildgebung mehrerer Organoide in einer Mikrotiterplatte.

• Die Silikonöl-Herausforderung: Das Bewegen des motorisierten Tisches zwischen den Vertiefungen (Kavitäten) führt häufig dazu, dass der Silikonölfilm reißt oder verbraucht wird, was zu Ausfällen bei automatisierter Bildgebung führt. In unseren Tests konnte das Silikonöl-Objektiv über die erste Vertiefung hinaus keinen Kontakt mehr halten (Abbildung 5).
• Vorteile des Silikongels: Das Silikongel-Immersionsobjektiv erfasste erfolgreich alle Zielorganoide über mehrere Vertiefungen hinweg, ohne dass es zu einem einzigen Kontaktverlust kam (Abbildung 6).

Der neue Standard für die Organoidforschung

Unsere Überprüfung bestätigt, dass das Silikongel-Immersionsobjektiv LUPLAPO25XS das Beste aus beiden Welten vereint: die Benutzerfreundlichkeit eines Luftobjektivs und die optische Leistung eines Immersionsobjektivs.

In Kombination mit dem Konfokal-Laserscanning-Mikroskop FV5000 hilft diese optische Technologie, mehrere Herausforderungen bei der Organoid-Bildgebung zu lösen – Ein Reißen des Ölfilms, Reinigungsschritte zwischen den Beobachtungen und Unterbrechungen bei automatisierten Bildgebungsläufen.

Das Ergebnis: Forschende konzentrieren sich mehr auf ihre Experimente und weniger auf die Wahl des Objektivs..

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