Die lebenswissenschaftliche Forschung tritt in eine Ära des tiefgreifenden Wandels ein. In Bildgebungslaboren und zentralen Forschungseinrichtungen stehen Wissenschaftler vor der Herausforderung, den wachsenden Bedarf an hochauflösenden, quantitativen Daten zu erfüllen, um immer komplexere biologische Fragestellungen zu beantworten. Präzisionsbildgebung ist für Wissenschaftler an der Spitze der Neurowissenschaften, Zellbiologie, Arzneimittelentwicklung, Krebsforschung und Entwicklungsbiologie von zentraler Bedeutung.

Bisher waren Forscher oft gezwungen, in ihrer Arbeit schwierige Kompromisse einzugehen: das Abwägen zwischen Bildqualität und Geschwindigkeit oder das Opfern von experimenteller Tiefe zugunsten der Schonung der Probe. Die Aufnahme sensibler Prozesse in lebenden Zellen erforderte besondere Sorgfalt zum Schutz vor Phototoxizität, während die Bildgebung tiefer Gewebeschichten häufig durch optische Streuung oder komplizierte Gerätekonfigurationen eingeschränkt war. Selbst die grundlegende Reproduzierbarkeit stellte eine Herausforderung dar, da geringfügige Abweichungen bei der Instrumentenkalibrierung zu inkonsistenten Ergebnissen zwischen verschiedenen Anwendern, Experimenten oder Laboren führten.

Durch die Einführung des FLUOVIEW™ FV5000 Konfokal- und Multiphotonen-Laserscanning-Mikroskops können diese Barrieren der Vergangenheit angehören. „Der FV5000 definiert die Grenzen von Auflösung, Geschwindigkeit und experimenteller Vielseitigkeit neu“, sagt Buelent Peker, Senior Product Marketing Manager von Evident und anerkannter Experte für Laserscanning-Mikroskopie. „Was einst eine unglaubliche Herausforderung war, kann dank spannender neuer Entwicklungen in der Scantechnologie, bei Detektoren und Software nun zur Routine werden.“

Innovationen bei konfokalen Mikroskopen für die Lebenswissenschaften

Der FV5000 basiert auf bahnbrechenden Entwicklungen in der konfokalen Mikroskopie für die Lebenswissenschaften. In Kombination schaffen diese Innovationen ein grundlegend anderes Bildgebungserlebnis für Anwender aller Erfahrungsstufen – bei dem Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und quantitative Genauigkeit zusammenwirken und nicht gegeneinander arbeiten.

1. Quantitative Analyse mit Photonenzählung

Zu den bedeutendsten Fortschritten der modernen konfokalen Mikroskopie zählt die Photonenzähltechnologie. Traditionell verließen sich konfokale Mikroskope auf den Vergleich relativer Lichtintensitäten, um Unterschiede zwischen Proben abzuleiten. Während diese Methode qualitative Informationen liefert, ist sie jedoch sehr empfindlich gegenüber externen Faktoren wie Detektorspannung, Ausrichtung, Stabilität der Laserleistung und sogar Temperaturschwankungen im Labor. Geringfügige Abweichungen zwischen den Experimenten können zu inkonsistenten Messwerten führen. Dies macht quantitative Vergleiche unzuverlässig, insbesondere wenn versucht wird, Ergebnisse über verschiedene Zeitpunkte, Projekte oder Kooperationsstudien hinweg zu replizieren.

„Beim Vergleich von Intensitätsniveaus gibt es immer gewisse Schwierigkeiten“, sagt Peker. „Sie müssen Ihr Instrument sehr genau kontrollieren, und Ihre Detektoren müssen Ihnen eine Zählausgabe mit einer bestimmten Empfindlichkeit liefern – die Verstärkung des Signals, das Ihren Detektor erreicht, muss immer gleich sein, die Laserleistung, die Ihre Probe erreicht, muss immer gleich sein.“ Zusätzlich müssen Sie unbedingt darauf achten, immer denselben Kanal im System zu verwenden, da die Empfindlichkeit von Detektor zu Detektor variieren kann.

SilVIR™-Detektortechnologie

Der neue Maßstab in der fortschrittlichen Mikroskopie: Die SilVIR™-Detektortechnologie der nächsten Generation im FV5000 setzt einen neuen Standard, indem sie eine Quantifizierung auf Photonenebene ermöglicht, die dieses Paradigma grundlegend verändert. Durch das Erkennen und Zählen einzelner Photonen wird eine echte, absolute Messung der Fluoreszenzintensität geschaffen – anstelle einer bloßen relativen Schätzung. Dies verwandelt die konfokale Mikroskopie in ein absolut quantitatives Werkzeug und schließt die Lücke zwischen qualitativer Bildgebung und reproduzierbarer Datenanalyse.

Reproduzierbarkeit über Labore hinweg

Einer der Hauptvorteile der quantitativen Analyse ist die Reproduzierbarkeit über Labore hinweg. Bei groß angelegten Kooperationen oder standortübergreifenden Forschungsstudien ist eine zuverlässige Reproduzierbarkeit von größter Bedeutung—Photonenzählung eliminiert vorherige Variablen und ermöglicht es Forschern an verschiedenen Standorten, direkt vergleichbare Daten zu erheben.

Zur weiteren Sicherstellung der Konsistenz misst und kalibriert der Laser Power Monitor (LPM) des FV5000 die Laserleistung automatisch in Echtzeit. Dies gewährleistet, dass identische Bildgebungsbedingungen – wie Anregungsleistung und Detektorantwort – über verschiedene Sitzungen und Systeme hinweg beibehalten werden. Gemeinsam beseitigen die Photonenzählung und die LPM-Standardisierung zentrale Variabilitätsquellen und ermöglichen eine echte quantitative Vergleichbarkeit.

Dies ist besonders kritisch in Disziplinen wie den Neurowissenschaften oder der Arzneimittelforschung, wo experimentelle Replikation unabdingbar ist, um Ergebnisse zu validieren und die Integrität der Daten über alle Forschungsstandorte hinweg sicherzustellen.

Konsistenz innerhalb der Experimente

Die Verfolgung von Entwicklungsprozessen oder Krankheitsverläufen erfordert konsistente Bildgebung über Wochen oder sogar Monate. Die Photonenzählung gewährleistet konsistente und zuverlässige Messungen, sodass Wissenschaftler Zeitpunkte bedenkenlos vergleichen können, ohne sich Gedanken über alltägliche Kalibrierungsprobleme machen zu müssen.

Ergänzend dazu misst und kompensiert der Laser Power Monitor (LPM) kontinuierlich Laserleistungsschwankungen während der Datenerfassung. Dadurch bleiben die Anregungsbedingungen von Tag zu Tag identisch, selbst bei Langzeitexperimenten. Zusammen gewährleisten Photonenzählung und LPM-Stabilität quantitative Konsistenz – und ermöglichen es Forschern, subtile biologische Veränderungen zuverlässig zu verfolgen.

Die Abschaffung von Rätselraten

Noch vor Kurzem mussten Forschende viel Zeit darauf verwenden, die Detektoreinstellungen zu justieren, um Sättigung oder Störgeräusche zu vermeiden. Dies führt sowohl zu menschlichen Fehlern als auch zu einer erhöhten Komplexität der Arbeitsabläufe – was insbesondere für weniger erfahrene Anwender eine Herausforderung darstellt. Dank der SilVIR-Technologie der FV5000 entfallen diese manuellen Einstellungen, wodurch die Bildgebung für Anwender aller Erfahrungsstufen einfacher und zuverlässiger wird.

Die durch das FV5000 ermöglichte Quantifizierung auf Photonenebene beseitigt das Rätselraten bei der Präzisionsbildgebung und gewährleistet, dass die Ergebnisse in verschiedenen Experimenten und Laboren verlässlich sind.

2. Empfindlichkeit und Detektion mit hohem Dynamikbereich

Biologische Proben weisen oft extrem unterschiedliche Signalintensitäten auf. Zum Beispiel kann das Soma eines Neurons intensiv fluoreszieren, während die dünnen Axonfortsätze nur schwache Signale emittieren. Historisch mussten Forscher die Verstärkung oder Laserleistung manuell anpassen, um beide Arten von Signalen zu erfassen, was oft mehrere Aufnahmen mit unterschiedlichen Einstellungen erforderte.

Dieses Vorgehen ist zeitaufwändig und verhindert einen direkten quantitativen Vergleich zwischen Regionen oder Proben. Der hohe Dynamikumfang (HDR) des FV5000 – der größte in der Branche – löst diese Herausforderung, indem er gleichzeitig sowohl schwache als auch starke Signale in einem einzigen Bild erfasst. Dies ermöglicht eine außergewöhnliche Empfindlichkeit und erlaubt es Forschern, die volle Komplexität ihrer Proben zu erforschen.

„Idealerweise sollte man über einen sehr empfindlichen Detektor und einen hohen Dynamikbereich verfügen – beides bietet der FV5000“, erklärt Peker. „Bei herkömmlichen Systemen muss man, um Signalbereiche und Strukturen effektiv erkennen zu können, die Spannung anpassen, um besonders schwache Bereiche hervorzuheben – erhöht man jedoch die Spannung, erhält man eine andere Verstärkung und der Dynamikbereich wird kleiner.“ Andererseits müssen Sie bei sehr hellen Bereichen die Signalstärke bzw. Verstärkung herunterregeln. So kommt es dazu, dass Sie für verschiedene Bereiche derselben Probe ständig die Einstellungen erhöhen und verringern müssen – das ist weder ideal für die Konsistenz der Datenerfassung noch für den Vergleich der Intensität.“

Eliminierung gesättigter Bilder

Ein weiterer Nachteil der Unfähigkeit, schwache und helle Signale gleichzeitig darzustellen, ist die Entstehung gesättigter Bilder. Sättigung tritt auf, wenn helle Bereiche den Detektor überstrahlen, wodurch Daten abgeschnitten und die quantitative Integrität zerstört wird. Die HDR-Funktion der FV5000 beseitigt dieses Risiko und erhält die Bildinformationen über das gesamte Intensitätsspektrum.

„Am Ende des Tages vernichtet Sättigung alles, was analysiert werden muss – sie muss um jeden Preis vermieden werden.“ „HDR ist eine große Hilfe.“ — Buelent Peker

3. Breitband-Bildgebung und Scantechniken

Die konfokale Mikroskopie ist nicht länger auf den Bereich des sichtbaren Lichts beschränkt – das FV5000 kann mit Nahinfrarotlasern (NIR) den Bereich von 400–900 nm abdecken und ermöglicht so den Einsatz von NIR-Farbstoffen, die einzigartige Vorteile für die lebenswissenschaftliche Forschung bieten.

Tiefere Gewebedurchdringung

NIR-Licht wird in biologischen Geweben weniger gestreut und ermöglicht Forschern, tiefer in dreidimensionale Strukturen wie Organoide, Embryonen oder dicke Gewebeschnitte abzubilden. „Mit NIR-Farbstoffen können Forscher tiefer in dreidimensionales Gewebe und dicke Proben eindringen – die Eindringtiefe ist einfach besser, da es aufgrund rotverschobener Farbstoffe zu weniger Streuung kommt“, sagt Peker.

Reduzierte Phototoxizität

Die längeren Wellenlängen des FV5000 sind schonender für lebende Zellen und verlängern die Lebensfähigkeit von Langzeit-Lebendzellbildgebungsexperimenten. Dies ist besonders wertvoll für die Entwicklungsbiologie und Arzneimitteltests, bei denen die Zellen über Tage oder sogar Wochen gesund bleiben müssen. Laut Peker: „Mit NIR-Farbstoffen können Sie die Lebendzell-Bildgebung in einer Inkubationsumgebung deutlich länger durchführen – Ihre Zellen sterben nicht so schnell, da die Phototoxizität geringer ist.“

4. Dual-Galvo- und Resonanzabtastung

Traditionelle Galvo-Scans bieten zwar hohe Präzision, sind jedoch durch Geschwindigkeitsbeschränkungen limitiert, was die Aufnahme schneller biologischer Ereignisse oder das effiziente Scannen großer Gewebevolumina erschwert. Resonanzabtastung begegnet dieser Herausforderung und erhöht die Bildwiederholrate drastisch.

Der FV5000 kombiniert beide Scanstrategien und bietet Dual-Modus-Flexibilität. Der Galvo-Modus kann für Experimente genutzt werden, die ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis oder komplexe Stimulationsmuster erfordern, wie etwa die Optogenetik. Der Resonanzmodus, der sich ideal für die Hochgeschwindigkeitsbildgebung dynamischer Prozesse eignet, kann dann für Anwendungen wie Vesikeltransport, Kalziumspitzen oder Ganzhirnscans mit höherem Durchsatz verwendet werden.

„Die Scan-Flexibilität des FV5000 stellt sicher, dass Forschende ihr Imaging für jede Anwendung optimal anpassen können“, sagt Peker. „Da sowohl Galvo- als auch Resonanz-Scanning auf demselben System verfügbar sind, können Sie problemlos zwischen den Modi wechseln, ohne Kompromisse bei Leistung oder Bildqualität einzugehen.“

5. Bildgebung mit hoher Bildrate (FPS)

Das FV5000 bietet außerdem eine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung mit hoher Bildrate (Bilder pro Sekunde, FPS), die für bestimmte wissenschaftliche Aufgaben unerlässlich ist. Bildgebung mit hoher Bildrate (High FPS) eignet sich ideal zur Verfolgung sich schnell bewegender Zellstrukturen wie Vesikel oder Zytoskelettelemente sowie zur Erfassung schneller physiologischer Ereignisse. Bildgebung mit hoher Bildrate kann außerdem verwendet werden, um die Aufnahmezeiten für große XYZ-Mosaikscans zu reduzieren und so stundenlange Arbeitsabläufe um das Sechsfache bis Zehnfache zu beschleunigen.

_{Mausgehirnschnitt, geklärt mit SeeDB2. EYFP-positive kortikale Pyramidenzellen der Schicht 5 in Thy1-YFP-H. Probe mit freundlicher Genehmigung von: Dr. Satoshi Fujimoto und Dr. Takeshi Imai Satoshi Fujimoto und Takeshi Imai, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University.}

6. Faserlaser-Technologie

Die Multiphotonenanregung (MPE) ist entscheidend für die Bildgebung tief in dicken, streuenden Geweben, einschließlich Gehirnschnitten, Organoiden und lebenden Embryonen. Traditionelle MPE-Systeme setzten häufig sperrige Femtosekunden-Infrarotlaser ein, die große optische Tische, spezielle Klimaanlagen zur Wärmeregulierung und qualifiziertes technisches Personal erforderten. Diese Systeme waren unerschwinglich teuer und schwierig zu integrieren, weshalb MPE meist auf Einrichtungen mit großem Budget und umfangreichem Personal beschränkt war.

Durch die Integration innovativer Fortschritte in der Faserlasertechnologie revolutioniert das FLUOVIEW™ FV5000MPE den Bereich der Multiphotonenmikroskopie und ermöglicht es mehr Laboren, dicke 3D-Proben und lebende Organismen zu untersuchen.

Kompakt und zugänglich

Die Multiphotonen-Faserlaser des FV5000MPE sind deutlich kleiner und einfacher in bestehende Systeme zu integrieren als Femtosekunden-IR-Laser. Sie sind zudem wesentlich unempfindlicher gegenüber Umweltveränderungen wie Vibrationen oder Temperaturschwankungen.

Feste Wellenlängen

Die Faserlaser des FV5000MPE können bei einzelnen, festen Wellenlängen betrieben werden—etwa 920 bis 950 nm für die GFP-Anregung—was einen einfachen und kostengünstigen Betrieb ermöglicht und gleichzeitig die meisten gängigen Forschungsanforderungen abdeckt. „Fasergekoppelte Multiphotonenlaser mit fester Wellenlänge sind einfach zu steuern und zu handhaben“, sagt Peker. „Sie können sich also beispielsweise für 925 Nanometer bei einem festen MPE-Laser entscheiden und diesen verwenden, da dieser Bereich Ihr am häufigsten verwendetes Signal für GFP bei Studien an lebenden Tieren abdeckt.“

Tiefenbildgebung für alle

Eine kostengünstige, einfach zu implementierende Lösung für die routinemäßige Multiphotonenmikroskopie: Das FV5000MPE macht Multiphotonen-Technologie für kleinere Labore und zentrale Einrichtungen zugänglicher und erweitert ihren Einsatzbereich über Spitzenforschungszentren hinaus. Die Faserlaser des FV5000MPE vereinfachen nicht nur die Multiphotonenmikroskopie, sondern verbessern auch die Zuverlässigkeit und helfen Forschern so, lebende Organismen über längere Zeiträume abzubilden, ohne die Komplikationen herkömmlicher Systeme in Kauf nehmen zu müssen.

„Mit dem FV5000MPE ist die Multiphotonentechnologie zugänglicher, günstiger und leichter in Labore integrierbar“, sagt Peker. „Durch die jüngsten Entwicklungen sind wir in der Lage, ein MPE-System zu schaffen, das kompakt, einfach zu bedienen und leicht erweiterbar ist.“

Fasergekoppelte Laser ermöglichen erstmals Laboren, die bisher nicht über die entsprechenden Ressourcen verfügten, den Zugang zur Tiefengewebsbildgebung. „Dies ist ein wichtiger Schritt zur Demokratisierung der MPE-Technologie.“ — Buelent Peker

_{Kultivierte HeLa-Zellen, die Lifeact-mScarlet-I und EB3-3xmNeonGreen exprimieren.}

_{Probe mit freundlicher Genehmigung von: Haruka Mii, Prof. Kazuhiro Aoki, Graduiertenschule für Biowissenschaften, Universität Kyoto. Um mehr über den Ursprung der HeLa-Zellen zu erfahren, besuchen Sie henriettalacksfoundation.org.}

Ein technologischer Wendepunkt

Das neue FV5000 stellt einen technologischen Wendepunkt in der Konfokalmikroskopie dar. Mit Photonenzählung und aktiv gesteuerter sowie überwachter Beleuchtungsleistung können Forscher jetzt echte quantitative Daten erzeugen, die experiment- und laborübergreifend reproduzierbar sind. High-Dynamic-Range-Detektion eliminiert Bildsättigung und ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von schwachen und hellen Strukturen. Und die Kombination aus Galvo- und Resonanzabtastung definiert die Zeit bis zum Ergebnis neu und ermöglicht es, dynamische biologische Ereignisse in Echtzeit zu erfassen.

Zusätzlich trägt das FV5000MPE dazu bei, die Multiphotonenanregung zu demokratisieren und die Tiefengewebsbildgebung einem breiteren Spektrum von Laboren zugänglich zu machen.

Über diese Systemverbesserungen hinaus nutzt das FV5000 intelligente Automatisierung und KI-gesteuerte Software, um komplexe Arbeitsabläufe zu vereinfachen und Einrichtungszeiten zu verkürzen, sodass sowohl Konfokal- als auch Multiphotonensysteme für neue Anwender zugänglicher werden.

Das FLUOVIEW FV5000 ist ein All-in-One-Laserscanning-Mikroskopsystem, das Forschern ermöglicht, schneller, intelligenter und kreativer zu arbeiten und dabei publikationsreife Bilder sowie robuste quantitative Daten zu erzeugen.

„Das FV5000 ermöglicht es mehr Wissenschaftlern, die Grenzen der Entdeckung zu verschieben – fortschrittliche Bildgebung ist nicht länger auf spezialisierte Labore beschränkt.“ — Buelent Peker

Für Forscher in den Lebenswissenschaften war die Zukunft noch nie so aufregend.