Automatische sphärische Aberrationskorrektur für die hochauflösende, kontrastreiche Fluoreszenzbildgebung

Einführung

Fluoreszenzmikroskope werden in den Life Sciences und in der medizinischen Forschung meist für morphologische Untersuchungen und die quantitative Analyse von Zellen und anderen biologischen Proben verwendet. Bei der Entwicklung von Objektiven für biologische Mikroskope wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass ein Standard-Deckglas mit einer Dicke von 0,17 mm in engem Kontakt mit der Probe ist.

Wenn jedoch Objektive mit hoher numerischer Apertur (NA) verwendet werden, können kleine Abweichungen − wie Schwankungen in der Dicke des Deckglases oder eine tiefere Positionierung der Probe − eine sphärische Aberration verursachen, die die Bildqualität beeinträchtigt. Viele dieser Objektive mit hoher NA sind mit einer Korrekturmanschette, auch als Korrekturring bezeichnet, ausgestattet, um die sphärische Aberration der Dicke des Deckglases entsprechend anzupassen. Die Feineinstellung des Objektiv-Korrekturrings ist unerlässlich, um eine optimale Bildschärfe zu erreichen.

Die IXplore IX85 Plattform für inverse Mikroskope von Evident automatisiert diesen Prozess durch intuitive Software und einen motorisierten Korrekturring. Beim Klicken auf eine Schaltfläche in der cellSens Software passt die Plattform den Ring mit einem elektrischen Korrekturring-Steuermechanismus automatisch an zahlreiche Objektive mit hoher NA an. Dieses automatische Objektiv-Korrektursystem ermöglicht die effiziente Erfassung scharfer Bilder mit verringerter sphärischer Aberration, hoher Auflösung und hohem Kontrast.

Die Herausforderungen bei der sphärischen Aberrationskorrektur

Wenn die Dicke des Deckglases vom Standard-Design von 0,17 mm abweicht, treffen die zentralen und peripheren Lichtstrahlen, die das Objektiv passieren, nicht am selben Brennpunkt zusammen, was zu einer Verschlechterung von Auflösung und Kontrast führt. Dieses Phänomen wird als sphärische Aberration bezeichnet und kann durch Drehen des Korrekturrings zur Ausrichtung auf die Fokuspositionen der Lichtstrahlen korrigiert werden (Abbildung 2).

Der Prozess bringt mehrere Herausforderungen mit sich. Erstens muss eine gleichzeitige Feinabstimmung von Korrekturring und Fokus erfolgen, um die Position zu finden, bei der das Bild am schärfsten ist. Zweitens ist es oft erforderlich, den Punkt der besten Korrektur festzustellen, indem mehrere Bilder verglichen werden, um kleine Verbesserungen der Schärfe zu entdecken. Dazu gehören eine Feineinstellung des Rings, eine Anpassung des Fokus, eine Bewertung der Bildschärfe und eine Wiederholung des Prozesses, um die ideale Korrekturposition des Rings zu identifizieren. Mikroskopbenutzer brauchen Fachwissen, um diese präzisen Anpassungen vorzunehmen, was die Möglichkeit, eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen zu erreichen, einschränkt.

Manuelle Anpassungen sind ebenfalls zeitaufwendig − ein Problem der Fluoreszenzbildgebung, bei dem Photobleichung die Qualität der Probe während längerer Exposition verschlechtern kann. Bei der Fluoreszenzbildgebung liegen häufig von vorne herein schwache Signalstärken vor, daher ist die Beibehaltung eines hohen Kontrastes durch eine schnelle und präzise sphärische Aberrationskorrektur wesentlich für die präzise Visualisierung und Analyse.

Einführung einer Methode zur automatischen Korrektur der sphärischen Aberration

Die Bildschärfe kann durch die Stärke des Bildkontrastes ausgedrückt werden. Da sich der Korrekturringwinkel und die Fokusposition ändern, hat der daraus resultierende Bildkontrast eine schräge, gebirgsähnliche Form, wie in Abbildung 3a veranschaulicht. Die Spitze dieser Form (Abbildung 3b) ist der am stärkste korrigierte Status der sphärischen Aberration, und die Anpassung des Korrekturrings ist dieselbe wie bei der Feststellung dieser Spitzenposition. Wenn die Korrektur dort, wo sich die Abweichung von der Spitze befindet, unzureichend ist (Abbildung 3c), ist das Bild verschwommen, auch wenn der Fokus korrekt ist.

Das Erstellen einer solchen Heatmap erfordert gewöhnlich die Erfassung mehrere Bilder während der Veränderung von Korrekturring und Fokus. Dieser Prozess ist zeitaufwändig und führt zu einem Verblassen der Probe während der Fluoreszenzbeobachtung, was den Kontrast beeinträchtigt und die Genauigkeit kompromittiert. Daher muss die automatische sphärische Aberrationskorrektur schnell und genau sein, um das Verblassen zu minimieren.

Bei der neuen automatischen sphärischen Aberrationskorrektur für Fluoreszenzbeobachtung auf der IXplore IX85 Plattform mit der cellSens-Software macht man sich die Nelder-Mead-Methode zu Nutze, die eine effiziente Anpassung von Fokusposition und Korrekturwinkel ermöglicht.

Die Kontrast-Heatmap verändert den Gradienten und die Ausbreitung je nach Objektiv. Die Nelder-Mead-Methode ist jedoch robust gegen die Form der Optimierungs-Zielfunktion und kann angewandt werden, auch wenn sie nicht-linear ist. Dadurch ist sie für die Anpassung der für jedes Objektiv definierten Heatmap geeignet.

Die Suche nach dem maximalen Kontrast wird durch die Aktualisierung dreier Punkte durchgeführt, die als Simplex bezeichnet werden. Zuerst wird der Kontrast an den ersten drei Punkten ermittelt, wie in Abbildung 4 (1) gezeigt. Dann wird die Position des Punktes mit dem geringsten Kontrast aktualisiert (2). Der Prozess der Aktualisierung von einem oder zwei Punkten wird wiederholt, wobei das Simplex-Intervall verkürzt und die Suche beendet wird, wenn die Konvergenzkriterien unterschritten werden, wie in (3) bis (10) gezeigt. Durch adaptive Eingrenzung des Suchbereichs, anstatt den gesamten Bereich auf einmal zu durchsuchen, ermöglicht diese Methode eine Annäherung an die Position mit der höchsten Kontrasteffizienz ohne unnötige Bildgebungsschritte.

Die Nelder-Mead-Methode bietet den Vorteil einer schnellen Anpassung der Suche im Vergleich zu einer flächendeckenden Suche nach dem maximalen Kontrast. Unter Testbedingungen mit einem UPLXAPO40X Objektiv und einer Kamera-Expositionszeit von 200 Millisekunden braucht es mit der Nelder-Mead-Methode ca. 20 Sekunden. Mit der konventionellen flächendeckenden Methode braucht es dagegen ca. 45 Sekunden zur Ableitung der Position mit dem höchsten Kontrast. Diese Methode dauert länger, da sie den Korrekturringwinkel θ in 10 Teile und Z in 10 Teile unterteilt, wodurch 100 Punkte umfassend abgedeckt sind. Der Vergleich zeigt, dass die automatische Methode die Anpassungszeit um mehr als 50 Prozent reduziert.

Zusammenfassung

Der motorisierte Korrekturring und der Algorithmus für die automatische Anpassung auf der IXplore IX85 Plattform ermöglichen eine präzise und schnelle sphärische Aberrationskorrektur, deren manuelle Durchführung oft schwierig ist. Eine automatische sphärische Aberrationskorrektur minimiert auch die Photobleichung in der Fluoreszenzmikroskopie durch schnelle, präzise Anpassungen. Der Korrekturring ist nahtlos in das IX85 System integriert, über die cellSens Software leicht steuerbar und mit Standardobjektiven von Evident in zahlreichen Ausführungen kompatibel. Diese Innovation ermöglicht es Benutzern mit unterschiedlichem Kenntnisstand, scharfe Fluoreszenzbilder mit hoher Auflösung und hohem Kontrast zu erfassen.