TruResolution™: Automatisierte Korrektur sphärischer Aberration für hochauflösende Bildgebung tiefer Gewebeschichten

In den letzten Jahren haben sich die Mikroskopietechnologien in den Biowissenschaften rasant weiterentwickelt, wobei die Nachfrage nach hochauflösenden Bildgebungsverfahren für tiefliegende Gewebestrukturen stetig gestiegen ist. Allerdings wird die Tiefenbildgebung häufig durch optische Aberrationen beeinträchtigt – insbesondere durch sphärische Aberrationen, die die Bildqualität erheblich verschlechtern können. Eine präzise Korrektur dieser Aberrationen ist daher unerlässlich.

Dieses Whitepaper bietet einen detaillierten Überblick über die technologischen Innovationen und Vorteile des automatisierten sphärischen Aberrationskorrektursystems TruResolution™ in den konfokalen Mikroskopen FLUOVIEW™ FV5000 und den Multiphotonen-Laserscanning-Mikroskopen FV5000MPE. Die Diskussion verdeutlicht, wie das TruResolution-System durch Automatisierung und intelligente Optimierung herkömmliche Herausforderungen bei der Korrektur sphärischer Aberrationen bewältigt.

Ein Überblick über die manuelle Korrektur der sphärischen Aberration und ihre Herausforderungen

Objektive bestehen aus mehreren Linsenelementen und werden durch präzise Konstruktions- und Fertigungsprozesse hergestellt, um eine hochgenaue Beobachtung feiner Strukturen wie Zellen und Organellen zu ermöglichen. Diese Objektive wurden entwickelt, um Aberrationen (Fehler bei der Bildentstehung) zu unterdrücken und unter idealen Bedingungen extrem klare Präparatbilder zu ermöglichen.

Wenn jedoch der Brechungsindex des Mediums, wie beispielsweise des Präparats oder des Deckglases, von dem der Immersionsflüssigkeit abweicht, verursacht die Lichtbrechung eine Diskrepanz in der Fokustiefe zwischen den Strahlen, die durch die Mitte eintreten, und denen, die durch den Rand des Objektivs eintreten. Dieses als sphärische Aberration bekannte Phänomen führt zu einer verminderten Auflösung und Fluoreszenzintensität.

Um diese Aberration zu korrigieren, ist es effektiv, den in das Objektiv integrierten Korrekturring einzustellen. Durch Drehen des Korrekturrings kann der Unterschied in der Fokustiefe zwischen zentralen und peripheren Strahlen ausgeglichen werden, was zu einer optimalen Abbildungsleistung führt.

Wenn Sie beispielsweise mit einem Wasserimmersionsobjektiv in Wasser fokussieren (Abbildung 1a), erzielen Sie mit einer Einstellung des Korrekturrings auf 0 eine optimale Bildgebung. Bei der Beobachtung von Gewebe durch ein Deckglas (Abbildung 1b) hingegen kommt es zu sphärischen Aberrationen, wenn der Korrekturring nicht eingestellt ist, wodurch sich der Brennpunkt ausbreitet und die Auflösung und Fluoreszenzintensität verringert werden. Durch die richtige Einstellung des Korrekturrings (Abbildung 1c) kann diese Aberration wirksam korrigiert werden.

Bei der Laserscanning-Mikroskopie werden Beobachtungen jedoch in der Regel in einer Dunkelkammer durchgeführt, was die manuelle Einstellung des Korrekturrings während der Bildaufnahme erschwert. Darüber hinaus verändert die Einstellung des Korrekturrings die Fokusposition, sodass Erfahrung und Geschick erforderlich sind, um optimale Einstellungen zu erzielen.

Darüber hinaus tritt bei der Tiefengewebebildgebung selbst dann, wenn der Korrekturring nahe der Oberfläche eingestellt ist, bei zunehmender Beobachtungstiefe erneut eine sphärische Aberration auf (Abbildung 1d). Daher ist es äußerst schwierig, bei der Erfassung von Z-Stapel-Bildern für jede Tiefe den optimalen Korrekturwert festzulegen.

Figure 1: Schematic figures of spherical aberration caused by cover glass or tissue and the effect of correction collar adjustment.

^{Abbildung 1. Schematische Darstellungen der durch Deckgläser oder Gewebe verursachten sphärischen Aberration und der Wirkung der Einstellung des Korrekturrings.}

^{a) Fokussieren unter idealen Bedingungen. Bei der Beobachtung eines in Wasser getauchten Präparats mit einem Wasserimmersionsobjektiv konvergieren die Lichtstrahlen sowohl aus der Mitte als auch vom Rand des Objektivs in derselben Tiefe, sodass keine sphärische Aberration auftritt.}

^{b) Fokussierung mit sphärischer Aberration. Bei der Beobachtung von Gewebe durch ein Deckglas mit Wasser als Immersionsmedium verursacht die Brechung an der Glasgrenzfläche eine Diskrepanz in der Fokustiefe zwischen zentralen und peripheren Strahlen, was zu einer sphärischen Aberration führt.}

^{c) Fokussierung nach Korrektur der sphärischen Aberration. Durch die richtige Einstellung des Korrekturrings wird der Unterschied in der Fokustiefe zwischen zentralen und peripheren Strahlen ausgeglichen, wodurch ideale Fokussierungsbedingungen erreicht werden.}

^{d) Fokussierung auf tiefer gelegene Positionen nach Oberflächenkorrektur. Wenn der Korrekturring für die Oberflächenbeobachtung eingestellt ist und die Fokusebene tiefer verschoben wird, tritt erneut eine sphärische Aberration auf, wodurch sich der Fokuspunkt ausbreitet.}

Optimierung der sphärischen Aberrationskorrektur durch einen motorisierten Korrekturring und automatisierte Algorithmen

Das TruResolution-System löst herkömmliche Probleme bei der Korrektur sphärischer Aberrationen, indem es eine intuitive und präzise Einstellung des Korrekturrings ermöglicht.

Erstens können Benutzer durch die Ausstattung des Objektivs mit einem motorisierten Korrekturring diesen Ring über eine Software steuern, ohne das Objektiv physisch berühren zu müssen – selbst in Dunkelkammerumgebungen –, was die Bedienbarkeit erheblich verbessert. Darüber hinaus verfügt das System über einen Mechanismus, der die Z-Position des Objektivs automatisch an den Drehwinkel des Rings anpasst. Dadurch wird sichergestellt, dass die Fokusposition während der Einstellung des Rings stabil bleibt und jederzeit eine genaue Fokussierung gewährleistet ist (Abbildung 2a).

Darüber hinaus verfügt das TruResolution-System über einen intelligenten Algorithmus, der automatisch die optimale Position des Korrekturrings ermittelt. Durch die Erfassung mehrerer Bilder mit unterschiedlichen Ringeinstellungen und die Analyse ihrer Kontrastkurven ermittelt das System den Spitzenkontrastpunkt, um den idealen Korrekturwert mit hoher Präzision zu berechnen (Abbildung 2b). Dadurch können Anwender mit einem einzigen Klick über die Softwareoberfläche die optimale Korrektur vornehmen

Während der Z-Stapel-Bildaufnahme können Anwender die entsprechenden Ringpositionen für jede Tiefe vorab registrieren. Der Korrekturring dreht sich dann während der Bildgebung automatisch und sorgt so für eine optimale Bildqualität in jeder Fokusebene. Mit dem TruResolution-System ist es nun möglich, Z-Stapel-Bildgebung im tiefen Gewebe mit präziser sphärischer Aberrationskorrektur durchzuführen, was zu durchgehend hellen und hochauflösenden Bildern in allen Tiefen führt.

Figure 2: Change of focal plane by rotating correction collar. In case of conventional objective lens, focal plane changes by rotating the correction collar.

Figure 2: Finding optimum correction collar angle θopt.

^{Abbildung 2.} ^{Schematische Darstellungen der Steuerung des Korrekturrings und des Optimierungsalgorithmus im TruResolution-System.}

^{a) Wenn herkömmliche Objektivringe gedreht werden, ändert sich auch die Fokusebene (links). TruResolution-Objektive halten die Fokusebene aufrecht, indem sie die Z-Position des Objektivs entsprechend dem Drehwinkel automatisch ändern (rechts).}
^{b) Ermittlung des optimalen Winkels des Korrekturrings (θopt): Eine Kontrastkurve wird durch Berechnung des Kontrastwerts jedes aufgenommenen Bildes bei verschiedenen Winkeln des Korrekturrings ermittelt. Die optimale Position des Korrekturrings wird durch Bestimmung des Spitzenwerts dieser Kontrastkurve berechnet.}

Bildgebung in tiefem Gewebe in der Multiphotonenmikroskopie mit dem TruResolution-System

Das TruResolution-System ermöglicht präzise Einstellungen der Position des Korrekturrings während der tiefen Z-Stapel-Bildgebung, was bisher schwierig war. Dadurch können nun in allen Tiefen konsistent helle Bilder mit hoher Auflösung aufgenommen werden.

Dies ist besonders bei der Multiphotonen-Anregungsmikroskopie von Bedeutung, wo die Auflösung stark von der Größe des Anregungspunkts abhängt, da keine konfokalen Lochblenden oder Kameras vorhanden sind. Bei der Tiefengewebebildgebung neigen Fluoreszenzsignale aufgrund von Lichtstreuung dazu, abgeschwächt zu werden. Die Beibehaltung einer kleinen Anregungspunktgröße erhöht jedoch die Anregungsdichte und trägt so zum Ausgleich des Signalverlusts bei. Daher ist die Korrektur der sphärischen Aberration sowohl für die Auflösung als auch für die Fluoreszenzintensität von entscheidender Bedeutung.

Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Bildgebung von fluoreszierenden Kügelchen, die in ein Gel eingebettet sind, das den Brechungsindex und die Streueigenschaften von Mausgehirngewebe simuliert. Mit dem TruResolution-System bleibt die Größe des Anregungspunkts über unterschiedliche Tiefen hinweg konstant und die Bildhelligkeit stabil. Wenn hingegen der Korrekturring auf die Oberflächeneinstellung fixiert ist, nimmt die Punktgröße mit zunehmender Tiefe zu, was zu einer Verringerung der Helligkeit führt.

Figure 3: Fluorescent micro bead(φ200nm) in gel simulating optical characteristic of live mouse brain.

^{Abbildung 3.} ^{Auswirkung des TruResolution-Systems auf die Tiefenbildgebung von fluoreszierenden Mikrokügelchen in einem gehirnähnlichen Gel. Fluoreszierende Mikrokügelchen (Durchmesser = 200 nm) in einem Gel mit optischen Eigenschaften, die denen von lebendem Mausgehirn ähneln (Brechungsindex: 1,36, Lichtstreuungskoeffizient: 43 cm-1), angeregt bei 960 nm mit konstanter Laserleistung, die für alle Bilder verwendet wurde.}

^{Obere Reihe: XZ-Bilder von Mikrokügelchen, aufgenommen in verschiedenen Tiefen mit dem TruResolution-System zur automatischen Kompensation sphärischer Aberrationen.}
^{Untere Reihe: XZ-Bilder von Mikrokügelchen, aufgenommen in verschiedenen Tiefen unter Verwendung eines festen Korrekturrings, der ursprünglich für eine optimale Bildgebung an der Oberfläche des Gels eingestellt wurde.}
^{Die Bildhelligkeitsskalen werden bei jeder Tiefe normalisiert. Alle Bilder wurden mit dem Objektiv FV30-AC25W aufgenommen}

Als nächstes zeigt Abbildung 4 eine In-vivo-Bildgebung von neuronalen Dendriten im Mausgehirn in einer Tiefe von 400 µm. Mit dem TruResolution-System werden selbst unter identischen Anregungsbedingungen hellere und klarere Bilder erzielt.

Figure 4: In vivo observation of neuronal dendrite in a live mouse brain (Thy1-YFP-H mouse, sensory cortex) acquired at 400 µm depth, with excitation at 960 nm.

^Abbildung 4^{. In-vivo-Bildgebung neuronaler Dendriten im lebenden Mausgehirn (Thy1-YFP-H-Maus, sensorischer Kortex).}
^{Die Bilder wurden in einer Tiefe von 400 µm unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 960 nm und dem Objektiv FV30-AC25W mit identischer Anregungsintensität aufgenommen.}

^{Oberes Bild: Die automatische Kompensation der sphärischen Aberration durch das FV30-AC25W TruResolution-Objektiv liefert scharfe, kontrastreiche Bilder von dendritischen Dornfortsätzen.}
^{Bild unten: Zum Vergleich wurde dasselbe Sichtfeld mit dem für die Probenoberfläche optimierten Korrekturring aufgenommen, wie es bei herkömmlichen Korrekturringen üblich ist.}

Das TruResolution-System ist auch bei geklärten Gewebeproben effektiv. Bei geklärten Gewebeproben kann der Brechungsindex je nach den verwendeten Reagenzien erheblich variieren, was sich möglicherweise auf die optische Leistung auswirkt. Zum Beispiel ist das Objektiv XLPLN10XSVMP für einen Brechungsindexbereich von 1,33 bis 1,52 ausgelegt. Wenn jedoch der Korrekturring nicht richtig eingestellt ist, können Aberrationen auftreten, die zu einer Verschlechterung der Bildqualität führen.

Mit dem TruResolution-System kann der Korrekturring auch bei geklärten Proben automatisch eingestellt werden, was eine gleichbleibend helle und hochauflösende Bildgebung ermöglicht.

Abbildung 5a zeigt ein XZ-Bild eines Z-Stapels, der aus einem mit Sca l eA2 geklärten Mausgehirn gewonnen wurde und eine Tiefe von etwa 4 mm aufweist. Insbesondere wenn der Brechungsindex des Immersionsmediums mit dem der Probe übereinstimmt, ist nur eine einzige Einstellung des Korrekturrings erforderlich.

Abbildung 5b zeigt ein XY-Bild in einer Tiefe von 2,7 mm, wobei das mit dem TruResolution-System aufgenommene Bild im Vergleich zu dem mit einem festen Korrekturring aufgenommenen Bild deutlich heller und klarer ist.

Figure 5: Mouse brain (Thy1-YFP-H mouse）cleared with ScaleA2.

^{Abbildung 5.} ^{TruResolution-System für geklärte Mausgehirnproben.}

^{Die Mausgehirnproben wurden mit Sca}^l^{eA2 geklärt. Das linke Bild wurde mit automatischer Einstellung des Korrekturrings unter Verwendung des TruResolution-Systems aufgenommen, das rechte Bild mit manueller Einstellung des Korrekturrings auf der Grundlage des Brechungsindexes des Clearing-Reagens CUBIC. Die Anregungsintensität war unter beiden Bedingungen identisch. Anregungswellenlänge: 960 nm; Objektiv: FV30-AC10SV.}
^{a) Maximale Intensitätsprojektion eines 250 µm dicken Schnitts entlang der Y-Achse nach Z-Stapel-Aufnahme.}

^{b) Maximale Intensitätsprojektion eines 100 µm dicken Schnitts in einer Tiefe von 2,7 mm entlang der Z-Achse.}

Hochauflösende Bildgebung in der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie mit dem TruResolution-System

Bei der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie können Schwankungen in der Dicke des Deckglases zu sphärischen Aberrationen führen, wodurch es schwierig wird, hochauflösende Bilder zu erhalten. Wenn der Korrekturring nicht richtig eingestellt ist, können Bilder unscharf und dunkel erscheinen, was die Beobachtungsgenauigkeit erheblich beeinträchtigt.

Die IXplore™ IX85-Inversmikroskop-Plattform ist mit einem motorisierten Korrekturring-Antrieb ausgestattet, der mit den meisten Evident-Objektiven kompatibel ist, die über einen Korrekturring verfügen und für Inversmikroskope ausgelegt sind. Durch den Wechsel der Objektive je nach Beobachtungszweck kann das System flexibel als Teil des TruResolution-Systems betrieben werden.

Abbildung 6 zeigt XYZ-Bilder, die aus der Z-Stapel-Bildgebung eines mit RapiClear geklärten Mausgehirnschnitts gewonnen wurden. Bei Verwendung des TruResolution-Systems wird sowohl die XY- als auch die Z-Achsenauflösung verbessert, was zu helleren und schärferen Bildern führt.

^{Abbildung 6.} ^{Konfokale Bildgebung eines mit RapiClear 2 geklärten Mausgehirnschnitts.}

^{Ein Z-Stapel von 27 Bildern wurde in Abständen von 0,85 µm mit dem Objektiv LUPLAPO25XO (NA 1,0, WD 1 mm) aufgenommen. Die dargestellten Bilder umfassen Projektionen mit maximaler Intensität (MIP) der XY-Ebene sowie Querschnittsansichten in der XZ- und YZ-Ebene. Magenta: DAPI-gefärbte Zellkerne. Grün: GFP-gekennzeichnete Neuronen.}

^{a) Bild, aufgenommen mit automatischer Korrektur des Korrekturrings mithilfe des TruResolution-Systems.}
^{b) Das Bild wurde aufgenommen, während der Korrekturring vollständig in Richtung des niedrigsten Brechungsindex gedreht war. Dieser Zustand entspricht dem Szenario, in dem der Korrekturring gehalten und gedreht wird, während das Objektiv an den drehbaren Objektivrevolver angebracht wird.}
^{Diese Ergebnisse bestätigen, dass die automatische Einstellung des Korrekturrings mit dem TruResolution-System die Aufnahme hellerer Bilder mit höherer Auflösung ermöglicht.}

Fazit

Dieses Whitepaper beschreibt detailliert die Technologie zur automatischen Korrektur der sphärischen Aberration durch das TruResolution-System und belegt dessen Wirksamkeit. Traditionell stellte die Einstellung des Korrekturrings bei der Tiefengewebe-Bildgebung oder bei der Arbeit mit geklärten Proben eine große Herausforderung dar, was oft zu einer inkonsistenten Bildqualität und einer komplexen Bedienung führte.

Das TruResolution-System löst diese Probleme grundlegend durch eine Reihe integrierter Funktionen: motorisierte Steuerung des Korrekturrings, automatische Aufrechterhaltung der Fokusposition, intelligente Ermittlung der optimalen Korrektureinstellungen und vollständige Kompatibilität mit der Z-Stapel-Bildgebung.

Da die Nachfrage nach tiefergehender Bildgebung und Anpassung an unterschiedliche Probenbedingungen weiter wächst, wird erwartet, dass das TruResolution-System als Kerntechnologie für hochpräzise und hochreproduzierbare Bildgebung dienen und damit die Möglichkeiten der mikroskopischen Beobachtung erheblich erweitern wird.

Autor

Hiromi Utsunomiya
Life Science High-End-Bildgebung, Produktmanagement, Evident

Danksagung

Die Anwendungsbilder wurden im RIKEN CBS-EVIDENT Open Collaboration Center aufgenommen, mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hiromu Monai, Dr. Hajime Hirase und Dr. Atsushi Miyawaki.

Literaturnachweise

Weitere Informationen zu den in diesem Whitepaper erwähnten Studien finden Sie im folgenden Artikel:

1. Ue, Y., Monai, H., Higuchi, K., et al. „A Spherical Aberration-Free Microscopy System for Live Brain Imaging“. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, Bd. 500, 236–241.

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