Los organoides, que imitan órganos humanos, son cada vez más vitales en el cribado de fármacos y el modelado de enfermedades. Sin embargo, su significativo grosor y tamaño presentan desafíos únicos para la microscopía.

Normalmente, los investigadores utilizan un flujo de trabajo que alterna entre baja magnificación para la navegación y alta magnificación para obtener detalles, o emplean la unión de imágenes para capturar el espécimen completo. Aunque los objetivos estándar de aire (secos) son convenientes, a menudo resultan insuficientes en resolución y distancia de trabajo al obtener imágenes en profundidad dentro del organoide.

Para lograr imágenes 3D de alta resolución, los microscopios confocales combinados con objetivos de inmersión líquida (agua, aceite o aceite de silicona) son el método de referencia. Sin embargo, estos enfoques plantean desafíos operativos: El contacto con el aceite puede romperse durante el movimiento de la platina, y el aceite residual en la placa puede degradar las imágenes al volver a utilizar objetivos de aire.

En esta publicación, evaluamos una solución innovadora: un lente objetivo de inmersión en gel de silicona, el primero de su tipo (LUPLAPO25XS), combinado con el microscopio de escaneo láser confocal FLUOVIEW™ FV5000 para la obtención de imágenes de organoides cerebrales. Exploramos las tres principales ventajas de esta tecnología óptica en comparación con el uso de objetivos convencionales de inmersión en aceite de silicona.

Protocolo para el experimento de obtención de imágenes de organoides

Para evaluar los beneficios de la inmersión en gel de silicona, utilizamos el organoide producido mediante el siguiente protocolo:

Generación de organoides cerebrales
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs; línea 201B7) se mantuvieron en condiciones de no diferenciación utilizando el medio eTeSR (STEMCELL Technologies). Los organoides cerebrales se generaron utilizando el kit de organoides cerebrales STEMdiff (STEMCELL Technologies). El proceso de diferenciación, que incluye la formación del cuerpo embrionario, la inducción del neuroectodermo y la posterior maduración del organoide, se llevó a cabo siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit de organoides cerebrales STEMdiff.

Inmunotinción y aclaramiento de tejidos
Los organoides se fijaron y se sometieron a inmunotinción utilizando DAPI para el marcaje nuclear, anti-TUJ1 (Alexa Fluor 488) para marcadores neuronales y anti-PAX6 (Alexa Fluor 594) para marcadores de progenitores neuronales. Después de la tinción, las muestras se aclararon utilizando el reactivo de aclaramiento de tejidos Sca l eS4 antes de la obtención de imágenes.

3 ventajas de utilizar la inmersión en gel de silicona para la obtención de imágenes de organoides cerebrales

El experimento demostró cómo el objetivo de inmersión en gel de silicona LUPLAPO25XS, combinado con el microscopio confocal FV5000, superó los desafíos operativos comunes en la obtención de imágenes de organoides cerebrales. Estas son las tres ventajas clave:

1. Estabilidad del eje Z: Libre de pérdida de contacto

La inmersión convencional en aceite de silicona requiere un puente líquido continuo entre el lente y la placa. Durante la adquisición de imágenes en apilamiento Z profundo o ajustes significativos del enfoque Z, este puente puede romperse fácilmente.

• El reto del aceite de silicona: Una vez que se pierde el contacto con el aceite de silicona, al volver a la coordenada Z original, a menudo se obtiene una imagen borrosa porque el aceite no vuelve a formar un menisco perfecto de manera automática. Los investigadores deben intervenir manualmente para volver a aplicar el aceite o ajustar el lente, interrumpiendo el experimento (Figura 1).
• La ventaja del gel de silicona: Gracias a las propiedades elásticas del gel de silicona, el contacto es resiliente. Aunque el lente se aleje considerablemente de la placa, al volver a la coordenada Z objetivo se recupera instantáneamente una imagen de alta resolución. Esto permite ajustes de enfoque más flexibles y sesiones de captura de imágenes altamente reproducibles (Figura 2).

2. Cambio de lentes sin interrupciones: Flujo de trabajo libre de limpieza

En un flujo de trabajo de observación típico, los investigadores suelen volver a utilizar un objetivo de aire de baja magnificación después de una inspección de alta resolución.

• El reto del aceite de silicona: El aceite de silicona deja un residuo sucio en el fondo de la placa de imagen. Si se cambia a un objetivo de aire sin limpiar a fondo la placa, el aceite residual puede causar una aberración esférica grave, lo que hace que la imagen sea inutilizable. Este proceso de limpieza requiere mucho tiempo y puede perturbar la muestra (Figura 3).
• La ventaja del gel de silicona: El gel de silicona no es migratorio y no deja ningún residuo líquido en la placa. Nuestra verificación demostró que se puede cambiar del objetivo de gel a un objetivo de aire y continuar la observación inmediatamente sin degradación de la imagen. Esto permite un flujo de trabajo sin interrupciones que combina la conveniencia de los objetivos secos con el rendimiento óptico de la imagen por inmersión (Figura 4).

3. Éxito automatizado en placas de múltiples pocillos: Estabilidad en la unión de imágenes

La investigación de alto rendimiento a menudo requiere la unión de imágenes y la obtención de imágenes 3D a través de múltiples organoides en una placa de múltiples pocillos.

• El reto del aceite de silicona: El desplazamiento de la platina entre pocillos a menudo provoca la separación o el agotamiento del aceite de silicona, lo que conduce a fallos en las ejecuciones de imágenes automatizadas. En nuestras pruebas, el lente objetivo de aceite de silicona no logró mantener el contacto más allá del primer pocillo (Figura 5).
• La ventaja del gel de silicona: El objetivo de inmersión en gel de silicona capturó con éxito todos los organoides seleccionados en múltiples pocillos sin que se produjera ni una sola pérdida de contacto (Figura 6).

El nuevo estándar para la investigación de organoides

Nuestra verificación confirma que el objetivo de inmersión en gel de silicona LUPLAPO25XS ofrece lo mejor de ambos mundos: la facilidad de uso de un objetivo de aire y el rendimiento óptico de un objetivo de inmersión.

En combinación con el microscopio de escaneo láser confocal FV5000, esta tecnología óptica ayuda a abordar múltiples desafíos en la obtención de imágenes de organoides: pérdida de contacto con el aceite, pasos de limpieza entre observaciones e interrupciones en ejecuciones automatizadas de imágenes.

El resultado: los investigadores pueden concentrarse más en sus experimentos y menos en el lente objetivo.

Descubra cómo la tecnología de inmersión en gel de silicona puede agilizar la obtención de imágenes de organoides, manteniendo al mismo tiempo una alta calidad y reproducibilidad de imagen. Contacta hoy mismo con el equipo de Evident para obtener más información y programar una demostración.