La investigación en ciencias de la vida está entrando en una era transformadora. En laboratorios de imagen y en instalaciones centrales de investigación, los científicos se enfrentan a una demanda creciente de datos cuantitativos de alta resolución para responder a preguntas biológicas cada vez más complejas. La obtención de imágenes de precisión lo es todo para los investigadores que lideran los campos de la neurociencia, la biología celular, el descubrimiento de fármacos, la investigación del cáncer y la biología del desarrollo.

Históricamente, los investigadores a menudo han tenido que hacer difíciles concesiones en su trabajo: Equilibrar la calidad de imagen con la velocidad, o sacrificar profundidad experimental por preservación de la muestra. La captura de procesos celulares vivos delicados requería precaución para evitar la fototoxicidad, mientras que la obtención de imágenes de tejidos profundos a menudo se veía limitada por la dispersión óptica o por configuraciones complejas de equipos. Incluso la reproducibilidad básica ha supuesto un reto, ya que pequeñas variaciones en la calibración de los instrumentos han dado lugar a resultados inconsistentes entre usuarios, experimentos o laboratorios.

Con la introducción del microscopio de barrido láser confocal y multifotón FLUOVIEW™ FV5000, estas barreras pueden quedar atrás. “El FV5000 redefine los límites de resolución, velocidad y versatilidad experimental”, afirma Buelent Peker, gerente sénior de marketing de producto en Evident y reconocido experto en microscopía de barrido láser. Lo que antes era sumamente complicado ahora puede convertirse en una tarea rutinaria gracias a los avances innovadores en tecnología de escaneo, detectores y software.

Nuevos avances en microscopios confocales para ciencias de la vida

El FV5000 se basa en nuevos y profundos avances en la microscopía confocal en las ciencias de la vida. Cuando se combinan, estas innovaciones crean una experiencia de imagen fundamentalmente diferente para usuarios de todos los niveles: una en la que la velocidad, la sensibilidad y la precisión cuantitativa colaboran en armonía, sin competir entre sí.

1. Análisis cuantitativo mediante conteo de fotones

Uno de los avances más transformadores en la microscopía confocal moderna es la tecnología de conteo de fotones. Tradicionalmente, los microscopios confocales dependían de la comparación de intensidades de luz relativas para inferir diferencias entre muestras. Si bien este método proporciona información cualitativa, es altamente sensible a factores externos como el voltaje del detector, la alineación, la estabilidad de la potencia del láser e incluso los cambios de temperatura en el laboratorio. Pequeñas variaciones entre experimentos pueden causar mediciones inconsistentes. Esto hace que las comparaciones cuantitativas sean poco fiables, especialmente cuando se intenta replicar resultados en diferentes momentos, proyectos o estudios colaborativos.

«Al comparar niveles de intensidad, siempre surgen algunas dificultades», afirma Peker. "Debe controlar su instrumento de manera muy estricta, y sus detectores deben proporcionarle una salida de conteo con una sensibilidad específica: la amplificación de la señal que llega a su detector debe mantenerse constante, al igual que la potencia del láser que llega a su muestra." Es importante asegurarse de utilizar siempre el mismo canal en el sistema, dado que la sensibilidad puede variar de un detector a otro.

Reproducibilidad entre laboratorios

Una de las principales ventajas del análisis cuantitativo es la reproducibilidad entre laboratorios. Para colaboraciones a gran escala o estudios multicéntricos, la reproducibilidad fiable es primordial: el recuento de fotones elimina variables anteriores y permite a los investigadores de diferentes instalaciones recopilar datos directamente comparables.

Para asegurar una mayor consistencia, el monitor de potencia láser (LPM) del FV5000 mide y calibra automáticamente la potencia de salida del láser en tiempo real. Esto garantiza que se mantengan las mismas condiciones de imagen, por ejemplo, la potencia de excitación y la respuesta del detector, durante todas las sesiones y en todos los sistemas. Juntos, el recuento de fotones y la estandarización del LPM eliminan las principales fuentes de variación, lo que permite una verdadera comparabilidad cuantitativa.

Esto es especialmente crucial en disciplinas como la neurociencia o el descubrimiento de fármacos, donde la replicación experimental es esencial para validar los resultados y garantizar la integridad de los datos en diferentes sitios de investigación.

Consistencia dentro de los experimentos

El seguimiento de los procesos de desarrollo o de la progresión de enfermedades requiere la obtención de imágenes de forma constante durante semanas o incluso meses. El recuento de fotones garantiza mediciones consistentes y fiables, permitiendo a los científicos comparar distintos puntos temporales con confianza, sin preocuparse por problemas de calibración diaria.

Complementando esto, el Laser Power Monitor (LPM) mide y compensa continuamente las fluctuaciones de potencia del láser durante la adquisición. Esto mantiene condiciones de excitación idénticas día tras día, incluso en experimentos de larga duración. Juntos, el conteo de fotones y la estabilidad del LPM salvaguardan la consistencia cuantitativa, permitiendo a los investigadores rastrear cambios biológicos sutiles con confianza.

La eliminación de las conjeturas

Anteriormente, los científicos tenían que dedicar tiempo valioso a ajustar la configuración de los detectores para evitar la saturación o el ruido. Esto introduce tanto errores humanos como complejidad en el flujo de trabajo, especialmente desafiante para los usuarios menos experimentados. Con la tecnología SilVIR del FV5000, se elimina la necesidad de ajustes manuales, facilitando y haciendo más confiable la obtención de imágenes para usuarios de todos los niveles de experiencia.

“La cuantificación a nivel de fotones que permite el FV5000 elimina la incertidumbre en la obtención de imágenes de precisión y asegura que los resultados sean confiables en diferentes experimentos y laboratorios.”

2. Sensibilidad y detección de alto rango dinámico

Las muestras biológicas suelen presentar intensidades de señal extremadamente diversas. Por ejemplo, el soma neuronal puede fluorescer intensamente, mientras que los procesos axonales finos producen señales débiles. Históricamente, los investigadores tenían que ajustar manualmente la ganancia o la potencia del láser para capturar ambas señales, lo que a menudo requería múltiples imágenes con diferentes configuraciones.

Este enfoque requiere mucho tiempo e impide la comparación cuantitativa directa entre regiones o muestras. El alto rango dinámico (HDR) de la FV5000 —el más amplio de la industria— resuelve este desafío al capturar simultáneamente señales tenues y brillantes en una sola imagen. Esto proporciona una sensibilidad excepcional, lo que permite a los investigadores explorar toda la complejidad de sus muestras.

“Idealmente, se busca contar con un detector muy sensible y un alto rango dinámico, ambos presentes en el FV5000”, explica Peker. «Con los sistemas tradicionales, si querías observar eficazmente intensidades y estructuras, tendrías que ajustar el voltaje para destacar las partes más tenues; pero si aumentas el voltaje, entonces tienes una amplificación diferente y tu rango dinámico se reduce.» Por otro lado, si hay áreas muy brillantes, entonces se deben disminuir los niveles. Entonces terminas haciendo ajustes constantes en diferentes partes de la misma muestra, lo cual no es ideal para la consistencia de adquisición ni para la comparación de intensidades.»

Eliminación de imágenes saturadas

Otro inconveniente de no poder mostrar simultáneamente señales tenues y brillantes es la generación de imágenes saturadas. La saturación se produce cuando las regiones brillantes saturan el detector, recortando los datos y destruyendo la integridad cuantitativa. La tecnología HDR del FV5000 elimina este riesgo, preservando la información en todo el espectro de intensidad.

«En definitiva, la saturación mata todo lo que necesita ser analizado; debe evitarse a toda costa.» «HDR es de gran ayuda». — Buelent Peker

3. Técnicas de imagen y escaneo de banda ancha

La microscopía confocal ya no se limita a los rangos de luz visible: el FV5000 puede abarcar de 400 a 900 nm con láseres de infrarrojo cercano (NIR), lo que permite el uso de colorantes NIR que ofrecen beneficios únicos para la investigación en ciencias de la vida.

Mayor penetración tisular

La luz NIR dispersa menos en los tejidos biológicos, lo que permite a los investigadores obtener imágenes más profundas en estructuras 3D como organoides, embriones o cortes gruesos de tejido. “Con los colorantes NIR, puedes penetrar más profundamente en tejidos 3D y muestras gruesas; la profundidad de penetración es simplemente mejor, con menor dispersión debido a los colorantes más desplazados al rojo”, afirma Peker.

Fototoxicidad reducida

Las longitudes de onda más largas del FV5000 son más suaves para las células vivas, lo que prolonga la viabilidad de los experimentos de imagen de células vivas a largo plazo. Esto es especialmente valioso para la biología del desarrollo y las pruebas de fármacos, donde las células deben permanecer sanas durante días o incluso semanas. Según Peker, «Con colorantes NIR, es posible realizar imágenes de células vivas durante mucho más tiempo en un ambiente incubado; las células no morirán tan rápidamente debido a la menor fototoxicidad.»

4. Escaneo dual galvo y resonante

Si bien el escaneo galvo tradicional es preciso, sus limitaciones de velocidad dificultan la captura de eventos biológicos rápidos o el escaneo eficiente de grandes volúmenes de tejido. El escaneo resonante resuelve este problema, aumentando drásticamente la velocidad de fotogramas.

El FV5000 combina ambas estrategias de escaneo, ofreciendo flexibilidad de modo dual. El modo galvo puede utilizarse para experimentos que requieren una relación señal/ruido máxima o patrones de estimulación complejos, como la optogenética. El modo resonante, ideal para la obtención de imágenes a alta velocidad de procesos dinámicos, puede utilizarse para aplicaciones como el tráfico de vesículas, los picos de calcio o los escaneos completos del cerebro a mayor rendimiento.

«La flexibilidad de escaneo del FV5000 garantiza que los investigadores puedan optimizar sus imágenes para cualquier aplicación», afirma Peker. “Con ambos modos de escaneo, galvanométrico y resonante, disponibles en el mismo sistema, puede cambiar fácilmente entre modos según sea necesario sin comprometer el rendimiento ni la calidad de la imagen.”

5. Imágenes de alta velocidad de fotogramas por segundo (FPS)

El FV5000 también ofrece imágenes de alta velocidad de fotogramas por segundo (FPS), esenciales para tareas científicas específicas. La obtención de imágenes con alta velocidad de fotogramas por segundo (FPS) es ideal para rastrear estructuras celulares de rápido movimiento, como vesículas o elementos del citoesqueleto, y para capturar eventos fisiológicos rápidos. La obtención de imágenes con alta velocidad de fotogramas (FPS) también puede utilizarse para reducir los tiempos de adquisición en grandes escaneos de mosaico XYZ, acelerando procedimientos que usualmente toman horas hasta seis a diez veces más rápido.

_{Corte de cerebro de ratón aclarado con SeeDB2. Neuronas piramidales EYFP de la capa 5 cortical en Thy1-YFP-H. Muestra cortesía de: Dres. Satoshi Fujimoto y Takeshi Imai, Escuela de Posgrado en Ciencias Médicas, Kyushu University.}

6. Tecnología láser de fibra

La excitación multifotónica (MPE) es esencial para obtener imágenes en profundidad de tejidos gruesos y dispersores, incluyendo cortes de cerebro, organoides y embriones vivos. Los sistemas tradicionales de MPE a menudo dependían de voluminosos láseres infrarrojos de femtosegundo que requerían grandes mesas ópticas, aire acondicionado especializado para gestionar el calor y personal técnico cualificado. Estos sistemas eran prohibitivamente caros y difíciles de integrar, lo que significaba que la MPE solía estar limitada a instalaciones con grandes presupuestos y personal.

Al incorporar innovadores avances en tecnología de láser de fibra, el FLUOVIEW™ FV5000MPE está ayudando a transformar el campo multifotónico, permitiendo que más laboratorios estudien muestras 3D de gran espesor y organismos vivos.

Compacto y accesible

Los láseres de fibra multifotón del FV5000MPE son significativamente más pequeños y fáciles de integrar en los sistemas existentes que los láseres IR de femtosegundo. También son mucho menos sensibles a los cambios ambientales, como las vibraciones o las fluctuaciones de temperatura.

Longitudes de onda fijas

Los láseres de fibra del FV5000MPE pueden funcionar en longitudes de onda únicas y fijas (alrededor de 920 a 950 nm para la excitación de GFP), lo que permite un funcionamiento sencillo y asequible al tiempo que cubre la mayoría de las necesidades de investigación comunes. “Los láseres multifotónicos acoplados a fibra a una longitud de onda fija son fáciles de controlar y manejar”, afirma Peker. Así, puedes elegir y utilizar, por ejemplo, 925 nanómetros para un láser MPE fijo, que cubre la señal más utilizada para GFP en estudios con animales vivos.

Democratizando la obtención de imágenes profundas

Una solución asequible y fácil de implementar para la obtención de imágenes multifotónicas de rutina, el FV5000MPE hace que la multifotónica sea más accesible para laboratorios pequeños y instalaciones centrales, ampliando su alcance más allá de los centros de investigación de élite. Los láseres de fibra del FV5000MPE no solo facilitan la obtención de imágenes multifotónicas, sino que también mejoran la fiabilidad, permitiendo estudiar organismos vivos durante períodos prolongados sin las complicaciones de los sistemas tradicionales.

“Con el FV5000MPE, la tecnología de multiphotón es más accesible, más económica y más fácil de integrar en los laboratorios”, afirma Peker. «Los avances recientes nos han dado la capacidad de crear sistemas MPE compactos, fáciles de usar y fáciles de actualizar.»

“Los láseres acoplados por fibra están abriendo la puerta a la obtención de imágenes de tejidos profundos para laboratorios que antes no tenían tales recursos.” «Este es un paso importante hacia la democratización de la tecnología MPE.» — Buelent Peker

^{Células HeLa cultivadas que expresan Lifeact-mScarlet-I y EB3-3xmNeonGreen. Muestra cortesía de: Haruka Mii, Prof. Kazuhiro Aoki, Escuela de Graduados en Bioestudios, Kyoto University. Para obtener más información sobre el origen de las células HeLa, visite henriettalacksfoundation.org.}

Un punto de inflexión tecnológico

El nuevo FV5000 representa un punto de inflexión tecnológico en la microscopía confocal. Con el recuento de fotones y una potencia de iluminación controlada y monitorizada activamente, los investigadores ahora pueden generar datos verdaderamente cuantitativos que son reproducibles entre experimentos y laboratorios. La detección de alto rango dinámico elimina la saturación de la imagen y permite la captura simultánea de estructuras tenues y brillantes. Y la combinación de escaneo galvanométrico y resonante está redefiniendo el tiempo de obtención de resultados, permitiendo capturar eventos biológicos dinámicos en tiempo real.

Además, el FV5000MPE está ayudando a democratizar la excitación multifotónica, haciendo que la obtención de imágenes de tejidos profundos sea accesible a una gama más amplia de laboratorios.

Más allá de estos avances del sistema, el FV5000 utiliza automatización inteligente y software impulsado por IA para simplificar flujos de trabajo complejos y reducir los tiempos de configuración, haciendo que tanto los sistemas confocales como los multifotónicos sean más accesibles para los nuevos usuarios.

El FLUOVIEW FV5000 es un sistema de microscopio de escaneo láser todo en uno que permite a los investigadores trabajar de forma más rápida, inteligente y creativa, generando imágenes listas para su publicación y datos cuantitativos robustos.

«El FV5000 permite que más científicos amplíen los límites del descubrimiento: la obtención de imágenes avanzadas ya no está limitada a laboratorios especializados.» — Buelent Peker

Para los investigadores en ciencias de la vida, el futuro nunca ha parecido más emocionante.