Corrección automática de la aberración esférica para imágenes fluorescentes de alta resolución y alto contraste

Introducción

Los microscopios de fluorescencia se utilizan ampliamente en las ciencias de la vida y la investigación médica para la observación morfológica y el análisis cuantitativo de células y otras muestras biológicas. Las lentes objetivas para microscopios biológicos suelen diseñarse partiendo de la base de que un cubreobjetos estándar de 0,17 mm de grosor está en contacto directo con la muestra.

Sin embargo, cuando se utilizan lentes objetivo de alta apertura numérica (NA), pequeñas diferencias, como variaciones en el grosor del cristal de cubierta o un posicionamiento más profundo de la muestra, pueden provocar aberraciones esféricas que deterioran la calidad de la imagen. Muchas de estas lentes objetivo de alta NA están equipadas con un collarín de corrección, también conocido como anillo de corrección, para ajustar la aberración esférica según el grosor del cristal de cubierta. Es esencial ajustar con precisión el anillo de corrección del objetivo para lograr unaclaridad de imagen óptima.

La plataforma de microscopio invertido IXplore™ IX85 de Evident automatiza este proceso mediante un software intuitivo y un collarín de corrección motorizado. Con solo pulsar un botón en el software cellSens™, la plataforma utiliza un mecanismo de control de anillo de corrección eléctrico para ajustar automáticamente el collarín a una amplia gama de objetivos de alta NA. Este sistema automatizado de corrección objetiva permite obtener imágenes nítidas de forma eficiente, con una aberración esférica reducida y una altaresolución y contraste.

Los retos de la corrección de la aberración esférica

Cuando el grosor del cristal de cobertura se desvía del diseño estándar de 0,17 mm, los rayos de luz centrales y periféricos que atraviesan la lente del objetivo no convergen en el mismo punto focal, lo que provoca una disminución de la resolución y el contraste. Este fenómeno se conoce como aberración esférica y se puede corregir girando el collarín de corrección para alinear las posiciones focales de los rayos de luz (Figura 2).

El proceso presenta varios retos. En primer lugar, el collar de corrección y el enfoque deben ajustarse simultáneamente para encontrar la posición en la que la imagen sea más nítida. En segundo lugar, determinar el punto de mejor corrección a menudo requiere comparar varias imágenes para detectar pequeñas mejoras en la claridad. Esto implica girar el anillo, ajustar el enfoque, evaluar la claridad de la imagen y repetir el proceso para identificar la posición de corrección ideal en el collar. Los usuarios de microscopios necesitan experiencia pararealizar estos ajustes precisos, lo que limita la capacidad de lograr una alta reproducibilidad entre experimentos.

Los ajustes manuales también requieren mucho tiempo, lo que supone un problema en la obtención de imágenes por fluorescencia, donde el fotoblanqueo puede degradar la muestra durante una exposición prolongada. Los niveles de señal pueden ser ya bajos en la obtención de imágenes por fluorescencia, por lo que mantener un alto contraste mediante una corrección rápida y precisa de la aberración esférica es esencial para una visualización y un análisis precisos.

Presentación de un método automatizado de corrección de la aberración esférica

La claridad de la imagen se puede expresar mediante la intensidad del contraste de la imagen. A medida que cambian el ángulo del collarín de corrección y la posición del enfoque, el contraste de la imagen resultante forma una silueta inclinada, similar a una montaña, como se ilustra en la Figura 3a. El pico de esta forma (Figura 3b) es el estado más corregido de la aberración esférica, y ajustar el collarín de corrección equivale a encontrar esta posición de pico. Si la corrección es insuficiente, cuando se desvía del pico (Figura 3c), la imagen se verá borrosa,incluso si el enfoque es correcto.

Para crear un mapa térmico de este tipo, normalmente es necesario adquirir varias imágenes mientras se varían el collar de corrección y el enfoque. Este proceso lleva mucho tiempo y hace que la muestra se decolore durante la observación por fluorescencia, lo que afecta al valor de contraste y compromete la precisión. Por lo tanto, la corrección automática de la aberración esférica debe ser rápida y precisa para minimizar el desvanecimiento.

La corrección automática de la aberración esférica recientemente implementada para la observación de fluorescencia en la plataforma IXplore IX85 con el software cellSens adopta el método Nelder-Mead, lo que permite un ajuste eficiente de la posición del foco y el ángulo del collar de corrección.

El mapa de calor de contraste varía en cuanto al gradiente y la propagación dependiendo de la lente objetivo. Sin embargo, el método Nelder-Mead es robusto frente a la forma de la función objetivo de optimización y puede aplicarse incluso si es no lineal. Esto lo hace adecuado para ajustar el mapa de calor definido para cada lente objetivo.

La búsqueda del contraste máximo se realiza actualizando tres puntos denominados simplex. En primer lugar, el contraste se obtiene en los tres puntos iniciales, tal y como se muestra en la Figura 4 (1). A continuación, se actualiza la posición del punto con el contraste más bajo (2). El proceso de actualización de uno o dos puntos se repite, acortando el intervalo simplex y finalizando la búsqueda cuando cae por debajo del criterio de convergencia, como se muestra en (3) a (10). Al reducir el rango de búsqueda de forma adaptativa en lugar de explorar toda el área de una sola vez, este método permite acercarse a la posición con mayor contraste de manera eficiente sin pasos de imagen innecesarios.

El método Nelder-Mead tiene la ventaja de ajustar rápidamente la búsqueda en comparación con una búsqueda exhaustiva del contraste máximo. En condiciones de prueba utilizando una lente objetivo UPLXAPO40X y un tiempo de exposición de la cámara de 200 milisegundos, el método Nelder-Mead tarda unos 20 segundos. Por el contrario, el método exhaustivo convencional tarda unos 45 segundos en obtener la posición con el mayor contraste. Este método lleva más tiempo, ya que divide el ángulo del collarín de corrección θ en 10 partes y Zen 10 partes, cubriendo 100 puntos de forma exhaustiva. La comparación demuestra que el método automatizado reduce el tiempo de ajuste en más de un 50 %.

Resumen

El collarín de corrección motorizado y el algoritmo de ajuste automático de la plataforma IXplore IX85 permiten una corrección precisa y rápida de la aberración esférica, lo que a menudo resulta difícil de lograr manualmente. La corrección automática de la aberración esférica también minimiza el fotoblanqueo en la microscopía de fluorescencia con ajustes rápidos y precisos. El collarín se integra perfectamente en el sistema IX85, se controla fácilmente a través del software cellSens y es compatible con una amplia gama de objetivos estándar de Evident. Esta innovación permite a usuarios con distintos niveles de habilidad obtener imágenes fluorescentes nítidas con alta resolución y contraste.