Corrección automatizada de la aberración esférica TruResolution™ para la adquisición de imágenes de tejidos profundos en alta resolución
En los últimos años, las tecnologías de microscopía en las ciencias de la vida han avanzado rápidamente, con una demanda creciente de imágenes de alta resolución de estructuras de tejidos profundos. Sin embargo, la adquisición de imágenes profundas suele verse afectada por aberraciones ópticas, en particular por la aberración esférica, que puede degradar considerablemente la calidad de la imagen. Por lo tanto, corregir con precisión estas aberraciones es esencial.
En este documento técnico se ofrece una descripción detallada de las innovaciones tecnológicas y los beneficios que aporta el sistema automatizado de corrección de la aberración esférica TruResolution™ en los microscopios de escaneo láser FLUOVIEW™ confocal FV5000 y multifotón FV5000MPE. El análisis destaca cómo el sistema TruResolution aborda los desafíos convencionales en la corrección de la aberración esférica mediante la automatización y la optimización inteligente.
Una descripción general de la corrección manual de la aberración esférica y sus desafíos
Los objetivos están compuestos por múltiples elementos ópticos y se fabrican mediante procesos de diseño e ingeniería precisos para permitir la observación de alta exactitud de estructuras finas, como células y orgánulos. Estos objetivos están diseñados para suprimir las aberraciones (errores en la formación de la imagen), lo que permite obtener imágenes muy nítidas de las muestras en condiciones ideales.
Sin embargo, cuando el índice de refracción del medio, como la muestra o el cubreobjetos, difiere del del líquido de inmersión, la refracción de la luz provoca una discrepancia en la profundidad focal entre los rayos que entran por el centro y los que entran por la periferia del objetivo. Este fenómeno, conocido como aberración esférica, provoca una reducción de la resolución y la intensidad de la fluorescencia.
Para corregir esta aberración, es eficaz ajustar el collar de corrección integrado en el objetivo. Al girar el collar de corrección, se puede compensar la diferencia de profundidad focal entre los rayos centrales y periféricos, obteniendo así un rendimiento óptimo de adquisición de imágenes.
Por ejemplo, al enfocar en agua con un objetivo de inmersión en agua (Figura 1a), ajustar el collar de corrección a 0 proporciona una imagen óptima. Por el contrario, cuando se observa tejido a través de un cubreobjetos (Figura 1b), se produce una aberración esférica si no se ajusta el collar de corrección, lo que provoca que el punto focal se disperse y se reduzca la resolución y la intensidad de la fluorescencia. Un ajuste adecuado del collar de corrección (Figura 1c) puede corregir de forma eficaz esta aberración.
Sin embargo, en la microscopía de escaneo láser, las observaciones suelen realizarse en una sala a oscuras, lo que dificulta el ajuste manual del collar de corrección durante la adquisición de imágenes. Además, ajustar el collar de corrección altera la posición focal, lo que requiere experiencia y habilidad para lograr ajustes óptimos.
Asimismo, en la adquisición de imágenes de tejidos profundos, incluso si el collar de corrección se ajusta cerca de la superficie, la aberración esférica reaparece cuando aumenta la profundidad de la observación (Figura 1d). Por lo tanto, es sumamente difícil establecer el valor de corrección óptimo en cada profundidad al adquirir imágenes con apilamiento en Z.
Figura 1. Figuras esquemáticas de la aberración esférica causada por un cubreobjetos o tejido y el efecto del ajuste del collar de corrección.
a) Enfoque en condiciones ideales. Cuando se observa una muestra sumergida en agua con un objetivo de inmersión en agua, los rayos de luz tanto del centro como de la periferia del objetivo convergen a la misma profundidad, por lo que no se genera aberración esférica.
b) Enfoque con aberración esférica. Al observar tejido a través de un cubreobjetos con agua como medio de inmersión, la refracción en la interfaz del cubreobjetos produce una discrepancia en la profundidad focal entre los rayos centrales y los periféricos, lo que genera una aberración esférica.
c) Enfoque después de la corrección de la aberración esférica. Al ajustar correctamente el collar de corrección, se compensa la diferencia de profundidad focal entre los rayos centrales y los periféricos, logrando así las condiciones ideales de enfoque.
d) Enfoque en posiciones más profundas después de la corrección a nivel de superficie. Cuando el collar de corrección está configurado para la observación superficial y el plano focal se mueve a mayor profundidad, la aberración esférica se produce nuevamente, lo que causa que el punto focal se expanda.
Optimización de la corrección de la aberración esférica mediante un collar motorizado y algoritmos automatizados
El sistema TruResolution aborda los desafíos convencionales en la corrección de la aberración esférica al permitir un ajuste intuitivo y preciso del collar de corrección.
En primer lugar, al equipar el objetivo con un collar de corrección motorizado, los usuarios pueden controlar el collar mediante software sin tocar físicamente el objetivo, incluso en salas oscuras, lo que mejora considerablemente la operabilidad. Asimismo, el sistema incorpora un mecanismo que ajusta automáticamente la posición Z del objetivo en respuesta al ángulo de rotación del collar. Esto garantiza que la posición focal permanezca estable mientras se ajusta el collar, con lo que se mantiene un enfoque preciso en todo momento (Figura 2a).
Además, el sistema TruResolution integra un algoritmo inteligente que determina automáticamente la posición óptima del collar de corrección. Al adquirir varias imágenes con diferentes ajustes del collar de corrección y analizar sus curvas de contraste, el sistema identifica el punto máximo de contraste para calcular el valor de corrección ideal con alta precisión (Figura 2b). Esto permite a los usuarios aplicar la corrección óptima con un solo clic desde la interfaz del software.
Durante la adquisición de imágenes con apilamiento en Z, los usuarios pueden registrar previamente las posiciones adecuadas del collar para cada profundidad. Luego, el collar de corrección gira automáticamente durante la adquisición de imágenes, lo que garantiza una calidad de imagen óptima en cada plano focal. Con el sistema TruResolution, ahora es posible realizar la adquisición de imágenes con apilamiento en Z de tejidos profundos con una corrección precisa de la aberración esférica, lo que da como resultado imágenes constantemente brillantes y de alta resolución en todas las profundidades.
Figura 2. Figuras esquemáticas del control del collar de corrección y del algoritmo de optimización en el sistema TruResolution.
a) Cuando se giran los collares de los objetivos convencionales, el plano focal también cambia (izquierda). Los objetivos TruResolution mantienen el plano focal ajustando automáticamente la posición Z del objetivo en función del ángulo de rotación (derecha).
b) Encontrar el ángulo óptimo del collar de corrección (θopt): se determina una curva de contraste calculando el valor de contraste de cada imagen adquirida en diferentes ángulos del collar de corrección. La posición óptima del collar de corrección se calcula determinando el pico de esta curva de contraste.
Adquisición de imágenes de tejidos profundos en microscopía multifotónica con el sistema TruResolution
El sistema TruResolution ha permitido realizar ajustes precisos del collar de corrección durante la adquisición de imágenes profundas con apilamiento en Z, lo que antes resultaba difícil. Como resultado, ahora se pueden adquirir imágenes brillantes y de alta resolución de manera constante en todas las profundidades.
Esto resulta particularmente significativo en la microscopía de excitación multifotónica, donde la resolución depende en gran medida del tamaño del punto de excitación debido a la ausencia de estenopos confocales o cámaras. En las imágenes de tejidos profundos, las señales de fluorescencia tienden a atenuarse debido a la dispersión de la luz. Sin embargo, mantener un tamaño pequeño del punto de excitación aumenta la densidad de excitación, lo que ayuda a compensar la pérdida de señal. Por lo tanto, la corrección de la aberración esférica es de vital importancia tanto para la resolución como para la intensidad de la fluorescencia.
La figura 3 muestra los resultados de la adquisición de imágenes de microesferas fluorescentes incrustadas en un gel que simula el índice de refracción y las propiedades de dispersión del tejido cerebral de un ratón. Con el sistema TruResolution, el tamaño del punto de excitación se mantiene constante a través de distintas profundidades y el brillo de la imagen es establece. Por el contrario, cuando el collar de corrección se fija en la configuración de superficie, el tamaño del punto aumenta con la profundidad, lo que da como resultado una reducción del brillo.
Figura 3. Efecto del sistema TruResolution en la adquisición de imágenes profundas de microesferas fluorescentes en un gel que simula el tejido cerebral. Microesferas fluorescentes (diámetro = 200 nm) en un gel con características ópticas similares a las del cerebro de un ratón vivo (índice de refracción: 1,36, coeficiente de dispersión de luz: 43 cm-1) excitadas a 960 nm con potencia láser constante en todas las imágenes.
Fila superior: imágenes XZ de microesferas adquiridas a distintas profundidades mediante el sistema TruResolution para la compensación automatizada de la aberración esférica.
Fila inferior: imágenes XZ de microesferas adquiridas a diferentes profundidades mediante un collar de corrección fijo ajustado inicialmente para la adquisición de imágenes óptimas en la superficie del gel.
Las escalas de brillo de las imágenes se normalizan en cada profundidad. Todas las imágenes fueron adquiridas con el objetivo FV30-AC25W.
A continuación, la figura 4 muestra imágenes in vivo de dendritas neuronales en el cerebro del ratón a una profundidad de 400 µm. Con el sistema TruResolution se obtienen imágenes más brillantes y nítidas incluso en condiciones de excitación idénticas.
Figura 4. Adquisición de imágenes in vivo de dendritas neuronales en el cerebro de un ratón vivo (ratón Thy1-YFP-H, corteza sensorial).
Las imágenes se adquirieron a una profundidad de 400 µm con una longitud de onda de excitación de 960 nm y el objetivo FV30-AC25W, con intensidad de excitación idéntica.
Imagen superior: la compensación automatizada de la aberración esférica mediante el objetivo FV30-AC25W TruResolution produce imágenes nítidas y de alto contraste de espinas dendríticas.
Imagen inferior: para comparar, se capturó el mismo campo de visión con el collar de corrección optimizado para la superficie de la muestra, como es habitual con los collares de corrección convencionales.
El sistema TruResolution también es eficaz con muestras de tejido aclaradas. En muestras de tejido aclaradas, el índice de refracción puede variar considerablemente según los reactivos utilizados, lo que podría afectar el rendimiento óptico. Por ejemplo, el objetivo XLPLN10XSVMP admite un rango de índice de refracción de 1,33 a 1,52. Sin embargo, si el collar de corrección no está ajustado correctamente, pueden producirse aberraciones que degraden la calidad de la imagen.
Con el sistema TruResolution, el collar de corrección puede ajustarse automáticamente, incluso en muestras aclaradas, lo que permite una adquisición de imágenes brillantes y de alta resolución de manera constante.
La figura 5a muestra una imagen XZ de una pila Z obtenida de un cerebro de ratón aclarado con Sca l eA2, observada a una profundidad de aproximadamente 4 mm. Con el sistema TruResolution se obtuvieron imágenes brillantes y uniformes incluso en regiones profundas. En particular, cuando el índice de refracción del medio de inmersión coincide con el de la muestra, solo se requiere un único ajuste del collar de corrección.
La figura 5b presenta una imagen XY a una profundidad de 2,7 mm, donde la imagen adquirida con el sistema TruResolution es notablemente más brillante y nítida en comparación con la obtenida con un ajuste fijo del collar de corrección.
Figura 5. Sistema TruResolution para muestras de cerebro de ratón aclaradas.
Las muestras de cerebro de ratón se aclararon con ScaleA2. La imagen de la izquierda se obtuvo con el ajuste automatizado del collar de corrección mediante el sistema TruResolution, y la imagen de la derecha se obtuvo con el ajuste manual del collar de corrección basado en el índice de refracción del reactivo de aclaramiento CUBIC. La intensidad de excitación fue idéntica en ambas condiciones. Longitud de onda de excitación: 960 nm; Objetivo: FV30-AC10SV.
a) Proyección de intensidad máxima de una sección de 250 µm de grosor a lo largo del eje Y tras la adquisición de una pila Z.
b) Proyección de intensidad máxima de una sección de 100 µm de grosor a una profundidad de 2,7 mm a lo largo del eje Z.
Adquisición de imágenes de alta resolución en microscopía confocal de escaneo láser mediante el sistema TruResolution
En la microscopía confocal de escaneo láser, las variaciones en el grosor del cubreobjetos pueden causar aberración esférica, lo que dificulta la adquisición de imágenes de alta resolución. Si el collar de corrección no está ajustado correctamente, las imágenes pueden verse borrosas y tenues, lo que disminuye considerablemente la precisión de la observación.
La plataforma de microscopio invertido IXplore™ IX85 está equipada con una unidad motorizada para el collar de corrección, compatible con la mayoría de los objetivos Evident que cuentan con un collar de corrección y están diseñados para microscopios invertidos. Al cambiar los objetivos según el propósito de la observación, el sistema puede funcionar de manera flexible como parte del sistema TruResolution.
La figura 6 muestra imágenes XYZ adquiridas a partir de imágenes con apilamiento en Z de un corte de cerebro de ratón aclarado con RapiClear. Al utilizar el sistema TruResolution, se mejora la resolución de los ejes XY y Z, lo que produce imágenes más brillantes y nítidas.
Figura 6. Imágenes confocales de un corte de cerebro de ratón aclarado con RapiClear 2.
Se adquirió una pila Z de 27 imágenes a intervalos de 0,85 µm con el objetivo LUPLAPO25XO (NA 1,0, WD 1 mm). Las imágenes mostradas incluyen proyecciones de intensidad máxima (MIP) del plano XY y vistas transversales en los planos XZ e YZ. Magenta: núcleos teñidos con DAPI. Verde: neuronas marcadas con GFP.
a) Imagen adquirida con el ajuste automatizado del collar de corrección mediante el sistema TruResolution.
b) La imagen se capturó con el collar de corrección girado completamente hacia la dirección del índice de refracción más bajo. Esta condición corresponde al escenario en el que se sostiene y gira el collar de corrección mientras se fija el objetivo al portaobjetivos giratorio.
Estos resultados confirman que el ajuste automático del collar de corrección con el sistema TruResolution permite la adquisición de imágenes más brillantes y de mayor resolución.
Conclusión
En este documento técnico se detalla la tecnología de corrección automatizada de la aberración esférica que ofrece el sistema TruResolution, junto con su eficacia demostrada. Tradicionalmente, ajustar el collar de corrección durante la obtención de imágenes de tejidos profundos o al trabajar con muestras aclaradas ha planteado desafíos significativos, que a menudo dan como resultado una calidad de imagen inconsistente y una operación compleja.
El sistema TruResolution resuelve estos problemas de forma radical gracias a un conjunto de funciones integradas: control motorizado del collar de corrección, mantenimiento automatizado de la posición focal, determinación inteligente de los ajustes de corrección óptimos y compatibilidad total con la adquisición de imágenes con apilamiento en Z.
A medida que sigue creciendo la demanda de imágenes más profundas y de adaptación a diversas condiciones de muestra, se espera que el sistema TruResolution sirva como tecnología central que respalde la adquisición de imágenes de alta precisión y altamente reproducibles, ampliando enormemente las posibilidades de la observación microscópica.
Autor
Hiromi Utsunomiya
Imágenes de Vanguardia para Ciencias de la Vida, Gestión de Productos, Evident
Agradecimientos
Las imágenes de aplicación fueron adquiridas en el Centro de Colaboración Abierta RIKEN CBS-EVIDENT, cortesía del Dr. Hiromu Monai, el Dr. Hajime Hirase y el Dr. Atsushi Miyawaki.
Referencias
Para obtener más información sobre los estudios mencionados en este documento técnico, consulte el siguiente artículo:
1. Ue, Y., Monai, H., Higuchi, K., et al. “A Spherical Aberration-Free Microscopy System for Live Brain Imaging.” Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, Vol. 500, 236–241.
Soluciones para las ciencias de la vida
FV5000
Microscopio confocal de escaneo láser
- Claridad, velocidad y fiabilidad extraordinarias impulsadas por innovaciones revolucionarias.
- Los detectores SilVIR™ ofrecen cuantificación a nivel de fotones, sensibilidad excepcional y una relación señal/ruido ultra alta.
- Su rango dinámico inigualable captura todo el espectro de la señal y evita la saturación.
- Escaneo resonante 2K de alta velocidad y escaneo galvo 8K de alta densidad en una sola plataforma
- El software FLUOVIEW Smart™ simplifica el funcionamiento con controles intuitivos y automatización basada en IA
- El collar de autocorrección TruResolution™ optimiza el enfoque para más de 20 objetivos.
- El diseño modular admite hasta 10 líneas láser y futuras actualizaciones multifotónicas.
- Laser Power Monitor (LPM) garantiza una iluminación estable y resultados reproducibles a lo largo del tiempo.
FV5000MPE
Microscopio multifotónico de escaneo láser
- Los láseres compactos acoplados a fibra óptica permiten obtener imágenes cuantitativas profundas en tejidos dispersores.
- Excitación láser MPE simultánea de una, dos o tres líneas para imágenes de milímetros de profundidad.
- Las tecnologías SilVIR™, TruAI y TruSight™ ofrecen una relación señal/ruido y una claridad excepcionales.
- Objetivos optimizados para MPE, collar de autocorrección TruResolution™ y alineación automatizada del láser IR mantienen un enfoque nítido.
- Disponible como actualización para el sistema FV5000 o como sistema MPE completo
- Configuraciones láser totalmente ajustables disponibles para aplicaciones multifotónicas avanzadas.