La reproductibilité en microscopie confocale ne dépend pas uniquement de la préparation des échantillons et de la technique de l’utilisateur. Les performances de l’instrument, la stabilité de l’éclairage, la sensibilité de détection, les paramètres d’acquisition et la capture des métadonnées peuvent tous varier d’une session à l’autre.

Ces variables sont particulièrement difficiles à contrôler dans les centres d’imagerie partagés, où plusieurs chercheurs ayant des niveaux d’expérience différents utilisent le même instrument. Une approche plus cohérente de l’ e commence par l’identification des conditions susceptibles de varier, puis par le rapprochement de leur mesure et de leur contrôle de l’instrument lui-même.

Pour une explication plus détaillée et une évaluation pratique de votre centre, téléchargez le livre blanc intitulé « Garantir la reproductibilité de la microscopie confocale avant que les utilisateurs ne touchent au microscope ».

Pourquoi la reproductibilité est-elle difficile dans les centres d’imagerie partagés ?

La reproductibilité est difficile à garantir dans les centres d’imagerie partagés car la diversité des utilisateurs, les variations des conditions de l’instrument et des métadonnées incomplètes peuvent toutes affecter l’image finale. Le personnel du centre doit accompagner des chercheurs aux niveaux d’expérience variés, sans pour autant pouvoir observer chaque décision de configuration ni vérifier chaque condition d’acquisition en temps réel.

Une étude britannique de 2022, citée dans le livre blanc téléchargeable, a mis en évidence de grandes disparités dans la gestion des installations centrales, avec une même équipe de deux personnes chargée de gérer entre 20 et 280 utilisateurs. Cela rend la supervision manuelle difficile, en particulier lorsque la variabilité peut ne devenir apparente qu’après comparaison des images entre différentes sessions, différents utilisateurs ou différents lots d’échantillons.

Le défi lié à la documentation est tout aussi important. Une analyse de 240 articles de recherche réalisée en 2020, également mentionnée dans le livre blanc, a révélé que seuls 17,7 % des articles consacrés à la microscopie à fluorescence respectaient les normes minimales en matière de communication des paramètres d’acquisition et des métadonnées relatives aux équipements. Des détails importants peuvent donc manquer dans les documents publiés, même lorsque les images obtenues semblent adaptées à l’analyse.

La reproductibilité commence avant même la capture de la première image. Elle dépend de la capacité du système à mesurer et à contrôler les conditions qui déterminent l’image, plutôt que de s’en remettre entièrement à la mémoire, à la formation et à la documentation manuelle de l’utilisateur.

Pourquoi la puissance du laser et les réglages logiciels ne suffisent pas

Les pourcentages indiqués par le logiciel décrivent un réglage sélectionné, et non nécessairement la quantité de puissance laser délivrée à l’échantillon. Un journal de session qui enregistre un réglage du laser à 10 % documente la position d’un cadran, mais ne confirme pas la quantité d’illumination ayant atteint l’échantillon pendant l’acquisition.

Une étude, citée dans le livre blanc téléchargeable, a décrit des variations de la puissance laser pouvant aller jusqu’à un facteur 50 entre différents systèmes confocaux d’un même fournisseur. Au cours d’une seule session de trois heures, les lasers à état solide présentent généralement des fluctuations comprises entre 25 % et 50 %, selon ce même rapport.

Un même réglage logiciel peut donc correspondre à des conditions d’éclairage différentes d’un instrument à l’autre ou d’une session à l’autre. Pour l’imagerie quantitative, un pourcentage enregistré ne suffit pas à expliquer une différence d’intensité. La question pertinente n’est pas seulement de savoir quel réglage l’utilisateur a sélectionné, mais quelle puissance l’instrument a réellement délivrée au moment de l’acquisition.

Cette distinction constitue le point de départ de la reproductibilité au niveau de l’instrument : séparer la commande logicielle des performances mesurées de l’instrument.

Pourquoi la reproductibilité doit passer au niveau de l’instrument

La reproductibilité doit être déplacée au niveau de l’instrument car les installations partagées ne peuvent pas compter uniquement sur la formation des utilisateurs et la supervision manuelle pour contrôler toutes les conditions qui affectent une image. L’entretien régulier des microscopes et les vérifications visant à confirmer que le système fonctionne dans les limites de ses paramètres attendus représentent également une charge de travail importante pour le personnel de l’installation.

Le contrôle qualité au niveau de l’instrument peut prendre en charge plusieurs étapes du processus d’imagerie :

• Éclairage : un système de surveillance de la puissance laser peut mesurer la puissance de sortie du laser par rapport à une valeur de référence d’installation et permettre une correction lorsque la puissance délivrée varie.
• Performances de l’instrument : un système de surveillance des performances du microscope peut évaluer la puissance du laser, la sensibilité de détection et les performances d’imagerie selon un calendrier défini.
• Détection : la détection à résolution photonique peut fournir une base plus fiable pour comparer l’intensité d’une session à l’autre lorsque la configuration optique reste constante.
• Configuration du flux de travail : des outils automatisés peuvent contribuer à standardiser le positionnement des échantillons, la mise au point, le réglage de la puissance laser et les paramètres de démarrage pour les utilisateurs qui se relaient.

Toute variation introduite à l’un de ces niveaux peut se répercuter sur les données obtenues, même lorsque les autres conditions sont bien maîtrisées. Ensemble, ces fonctionnalités permettent de garantir des conditions d’acquisition comparables d’une session à l’autre et d’un utilisateur à l’autre sur un même système.

Comment le FLUOVIEW™ FV5000 favorise-t-il une imagerie reproductible ?

Le microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW™ FV5000 d’Evident favorise une imagerie reproductible grâce à la quantification par comptage de photons, à la correction de la dérive du laser, à la surveillance programmée des performances et à des outils de flux de travail automatisés dans des configurations compatibles.

Ses détecteurs SilVIR™ permettent une quantification au niveau des photons, tandis que le moniteur de puissance laser aide à maintenir une puissance de sortie laser constante d’une session à l’autre. Le moniteur de performances du microscope évalue la sensibilité du système et la cohérence de l’imagerie, aidant ainsi le personnel du laboratoire à identifier les changements de performances de l’instrument en quelques minutes. Le logiciel FLUOVIEW Smart™ fournit des outils automatisés qui peuvent aider à simplifier la configuration de routine pour les utilisateurs, quel que soit leur niveau d’expérience.

Découvrez-en davantage sur le logiciel FLUOVIEW Smart et son approche des flux de travail confocaux intuitifs et optimisés par l’IA.

Pour découvrir plus en détail comment SilVIR prend en charge l’imagerie confocale quantitative, consultez le livre blanc : Système de détecteurs SilVIR de nouvelle génération pour le microscope confocal à laser FLUOVIEW FV5000.

Établir une base de référence plus solide en matière de reproductibilité

La reproductibilité confocale dépend du contrôle des conditions qui façonnent une image, et non pas uniquement de l’examen de l’image après son acquisition. La puissance du laser, le comportement du détecteur, les performances optiques, les choix de configuration et les métadonnées contribuent tous à l’enregistrement associé à une expérience.

L’automatisation au niveau de l’instrument permet d’intégrer l’étalonnage, la surveillance des performances, la configuration de l’acquisition et la génération de rapports au flux de travail de base. Pour les plateformes d’imagerie partagées, cette approche peut aider les chercheurs à travailler avec davantage de confiance d’une session à l’autre, tout en fournissant aux responsables de la plateforme des preuves plus claires lorsqu’une image ou une expérience nécessite une investigation.

Téléchargez le livre blanc intitulé « Garantir la reproductibilité de la microscopie confocale avant que les utilisateurs ne touchent au microscope » pour découvrir comment ces différents niveaux fonctionnent ensemble et évaluer votre établissement à l'aide de la liste de contrôle en huit points.