Correction automatisée de l’aberration sphérique pour l’imagerie de fluorescence à haute résolution et à fort contraste

Introduction

Les microscopes à fluorescence sont largement utilisés en sciences de la vie et en recherche médicale pour l’observation morphologique et l’analyse quantitative des cellules et d’autres échantillons biologiques Les objectifs pour microscopes biologiques sont généralement conçus en supposant qu’une lamelle couvre-objet standard d’une épaisseur de 0,17 mm est en contact étroit avec l’échantillon.

Cependant, lors de l’utilisation d’objectifs à grande ouverture numérique (NA), de légères différences — comme des variations de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet ou un positionnement plus profond de l’échantillon — peuvent provoquer une aberration sphérique qui détériore la qualité de l’image. Bon nombre de ces objectifs à grande ouverture numérique (NA) sont équipés d’une bague de correction permettant de corriger l’aberration sphérique en fonction de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet. Le réglage précis de la bague de correction de l’objectif est essentiel pour obtenir une clarté d’image optimale.

La plateforme de microscope inversé IXplore™ IX85 d’Evident automatise ce processus grâce à un logiciel intuitif et à une bague de correction motorisée. D’un simple clic dans le logiciel cellSens™, la plateforme utilise un mécanisme de contrôle électrique de la bague de correction pour ajuster automatiquement la bague sur un large éventail d’objectifs à grande ouverture numérique (NA). Ce système automatisé de correction de l’objectif permet l’acquisition efficace d’images nettes avec une aberration sphérique réduite, ainsi qu’une haute résolution et un fort contraste.

Les défis de la correction de l’aberration sphérique

Lorsque l’épaisseur de la lamelle couvre-objet s’écarte de la valeur standard de 0,17 mm, les rayons lumineux centraux et périphériques traversant l’objectif ne convergent pas au même point focal, ce qui entraîne une diminution de la résolution et du contraste. Ce phénomène est connu sous le nom d’aberration sphérique, et il peut être corrigé en tournant la bague de correction afin d’aligner les positions focales des rayons lumineux (figure 2).

Le processus présente plusieurs défis. Tout d’abord, la bague de correction et la mise au point doivent être réglées simultanément pour trouver la position où l’image est la plus nette. Ensuite, déterminer le point de correction optimal nécessite souvent de comparer plusieurs images afin de détecter de légères améliorations de la netteté. Cela implique de tourner la bague, de régler la mise au point, d’évaluer la netteté de l’image, puis de répéter le processus afin d’identifier la position de correction idéale sur la bague. Les utilisateurs de microscope doivent posséder une certaine expertise pour effectuer ces réglages précis, ce qui limite la capacité à obtenir une haute reproductibilité d’une expérience à l’autre.

Les réglages manuels sont également chronophages — un problème en imagerie de fluorescence où le photoblanchiment peut dégrader l’échantillon lors d’une exposition prolongée. L’intensité des signaux est souvent faible en imagerie de fluorescence, il est donc essentiel de maintenir un contraste élevé grâce à une correction rapide et précise de l’aberration sphérique pour une visualisation et une analyse fiables.

Présentation de la méthode de correction automatisée de l’aberration sphérique

La netteté de l’image peut être exprimée par l’intensité du contraste de l’image. Lorsque l’angle de la bague de correction et la position de mise au point changent, le contraste de l’image qui en résulte forme une structure inclinée en forme de montagne, comme illustré à la figure 3a. Le sommet de cette forme (figure 3b) correspond à l’état de correction maximale de l’aberration sphérique, et le réglage de la bague de correction revient à trouver cette position de sommet. Si la correction est insuffisante, c’est-à-dire lorsqu’elle s’écarte du sommet (figure 3c), l’image sera floue même si la mise au point est correcte.

La création d’une telle carte nécessite généralement l’acquisition de plusieurs images tout en faisant varier la bague de correction et la mise au point. Ce processus est chronophage et entraîne la diminution de la fluorescence de l’échantillon pendant l’observation, ce qui affecte la valeur du contraste et compromet la précision. Par conséquent, la correction automatisée de l’aberration sphérique doit être rapide et précise afin de minimiser la diminution de la fluorescence.

La nouvelle correction automatisée de l’aberration sphérique pour l’observation de la fluorescence sur la plateforme IXplore IX85 avec le logiciel cellSens adopte la méthode de Nelder-Mead, qui permet un réglage efficace de la position de mise au point et de l’angle de la bague de correction.

La carte du contraste varie en gradient et en étendue selon l’objectif utilisé. Cependant, la méthode de Nelder-Mead est robuste vis-à-vis de la forme de la fonction de cible d’optimisation et peut être appliquée même si celle-ci est non linéaire. Cela la rend adaptée au réglage de la carte de contraste définie pour chaque objectif.

La recherche du contraste maximal s’effectue par modification de la position de trois points appelés un simplexe. Tout d’abord, le contraste est mesuré aux trois points initiaux, comme illustré à la figure 4 (1). Ensuite, la position du point présentant le contraste le plus faible est modifiée (2). Le processus de modification de la position d’un ou de deux points est répété avec réduction de l’intervalle entre les points du simplexe, la recherche se terminant lorsque celui-ci devient inférieur au critère de convergence, comme illustré de (3) à (10). En réduisant la plage de recherche de manière adaptative plutôt qu’en explorant l’ensemble de la zone d’un seul coup, cette méthode permet de s’approcher efficacement de la position offrant le contraste le plus élevé sans étapes d’imagerie inutiles.

La méthode de Nelder-Mead présente l’avantage d’ajuster la recherche rapidement par rapport à une recherche exhaustive du contraste maximal. Dans des conditions de test utilisant un objectif UPLXAPO40X et un temps d’exposition de la caméra de 200 millisecondes, la méthode de Nelder-Mead prend environ 20 secondes. En revanche, la méthode exhaustive classique prend environ 45 secondes pour déterminer la position offrant le contraste le plus élevé. Cette méthode prend plus de temps, car elle divise l’angle de la bague de correction θ en 10 parties et l’axe  Z en 10 parties, couvrant ainsi 100 points de manière exhaustive. La comparaison montre que la méthode automatisée réduit le temps de réglage de plus de 50 %.

Récapitulatif

La bague de correction motorisée et l’algorithme de réglage automatisé de la plateforme IXplore IX85 permettent une correction de l’aberration sphérique précise et rapide, ce qui est souvent difficile à réaliser manuellement. La correction automatisée de l’aberration sphérique minimise également le photoblanchiment en microscopie de fluorescence grâce à des réglages rapides et précis. Elle est parfaitement intégrée au système IX85, facilement contrôlable via le logiciel cellSens et compatible avec une large gamme des objectifs standard d’Evident. Cette innovation permet aux utilisateurs de tous niveaux de compétence d’acquérir des images de fluorescence nettes, à haute résolution et à fort contraste.