Correction automatisée de l'aberration sphérique TruResolution™ pour l'imagerie haute résolution des tissus profonds
Ces dernières années, les technologies de microscopie dans les sciences de la vie ont progressé rapidement, avec une demande croissante d’imagerie à haute résolution des structures tissulaires profondes. Cependant, l’imagerie profonde est souvent affectée par des aberrations optiques -notamment l’aberration sphérique, qui peut dégrader considérablement la qualité de l’image. Une correction précise de ces aberrations est donc essentielle.
Ce livre blanc présente en détail les innovations technologiques et les avantages apportés par le système de correction automatisée de l'aberration sphérique TruResolution™ intégré aux microscopes à balayage laser confocal FLUOVIEW™ FV5000 et aux microscopes à balayage laser multiphotonique FV5000MPE. La discussion met en lumière comment le système TruResolution relève les défis conventionnels de la correction des aberrations sphériques grâce à l'automatisation et à l'optimisation intelligente.
Aperçu de la correction manuelle de l'aberration sphérique et de ses difficultés
Les objectifs sont composés de plusieurs lentilles et fabriqués selon des procédés de conception et d'ingénierie précis afin de permettre une observation de haute précision des structures fines, telles que les cellules et les organites. Ces lentilles sont conçues pour supprimer les aberrations (erreurs dans la formation de l'image), permettant ainsi d'obtenir des images d'échantillons extrêmement nettes dans des conditions idéales.
Cependant, lorsque l'indice de réfraction du milieu, tel que l'échantillon ou la lamelle couvre-objet, diffère de celui du liquide d'immersion, la réfraction de la lumière entraîne une différence de profondeur focale entre les rayons entrant par le centre et ceux entrant par la périphérie de la lentille de l'objectif. Ce phénomène, connu sous le nom d'aberration sphérique, entraîne une réduction de la résolution et de l'intensité de fluorescence.
Le réglage de la bague de correction intégrée à la lentille de l'objectif permet de corriger cette aberration. En faisant pivoter la bague de correction, on peut compenser la différence de profondeur focale entre les rayons centraux et périphériques, ce qui aboutit à des performances d’imagerie optimales.
Par exemple, lorsque vous effectuez la mise au point dans l'eau à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau (Figure 1a), le réglage de la bague de correction sur 0 permet d'obtenir une image optimale. En revanche, lors de l'observation d'un tissu à travers une lamelle (Figure 1b), une aberration sphérique se produit si la bague de correction n'est pas ajustée, ce qui provoque l'étalement du point focal et réduit la résolution ainsi que l'intensité de fluorescence. Un réglage précis de la bague de correction (Figure 1c) peut corriger efficacement cette aberration.
Cependant, en microscopie à balayage laser, les observations sont généralement effectuées dans une salle sombre, ce qui rend difficile le réglage manuel de la bague de correction pendant l'acquisition d'images. De plus, le réglage de la bague de correction modifie la position focale, ce qui nécessite une expérience et un savoir-faire pour obtenir des réglages optimaux.
De plus, dans l'imagerie des tissus profonds, même si la bague de correction est ajustée près de la surface, l'aberration sphérique réapparaît lorsque la profondeur d'observation augmente (figure 1d). Il est donc extrêmement difficile de déterminer la valeur de correction optimale à chaque profondeur lors de l'acquisition d'images Z-stack.
Figure 1. Schémas illustrant l'aberration sphérique causée par le verre de couverture ou le tissu et l'effet du réglage de la bague de correction.
a) Mise au point dans des conditions idéales. Lorsqu'on observe un échantillon immergé dans l'eau à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau, les rayons lumineux provenant du centre et de la périphérie de la lentille convergent à la même profondeur, ce qui évite toute aberration sphérique.
b) Mise au point avec aberration sphérique. Lorsqu'on observe un tissu à travers une lamelle couvre-objet avec de l'eau comme milieu d'immersion, la réfraction à l'interface du verre provoque une différence de profondeur focale entre les rayons centraux et périphériques, ce qui entraîne une aberration sphérique.
c) Mise au point après correction de l'aberration sphérique. En ajustant correctement la bague de correction, la différence de profondeur focale entre les rayons centraux et périphériques est compensée, ce qui permet d'obtenir des conditions de mise au point idéales.
d) Mise au point sur des plans plus profonds après correction de surface. Lorsque la bague de correction est réglée pour l’observation en surface et que le plan focal est déplacé plus en profondeur, l’aberration sphérique réapparaît, provoquant l’élargissement du point focal.
Optimisation de la correction de l'aberration sphérique à l'aide d'une bague motorisée et d'algorithmes automatisés
Le système TruResolution répond aux défis conventionnels de la correction de l’aberration sphérique en permettant un réglage intuitif et précis de la bague de correction.
Tout d’abord, en équipant l’objectif d’une bague de correction motorisée, les utilisateurs peuvent contrôler cette dernière via un logiciel sans toucher physiquement l’objectif, même dans des environnements de chambre noire, améliorant ainsi considérablement l’opérabilité. En outre, le système comprend un mécanisme qui ajuste automatiquement la position Z de l'objectif en fonction de l'angle de rotation de la bague de correction. Cela garantit que la position focale reste stable lors de l’ajustement de la bague, maintenant une mise au point précise à tout moment (Figure 2a).
De plus, le système TruResolution intègre un algorithme intelligent qui détermine automatiquement la position optimale de la bague de correction. En acquérant plusieurs images avec différents réglages de la bague et en analysant leurs courbes de contraste, le système identifie le point de contraste maximal afin de calculer la valeur de correction idéale avec une grande précision (figure 2b). Cela permet aux utilisateurs d'appliquer la correction optimale en un seul clic depuis l'interface du logiciel.
Lors de l'acquisition d'images Z-stack, les utilisateurs peuvent pré-enregistrer les positions appropriées de la bague pour chaque profondeur. La bague de correction effectue alors une rotation automatique lors de l’imagerie, garantissant une qualité d’image optimale à chaque plan focal. Grâce au système TruResolution, il est désormais possible de réaliser une imagerie Z-stack des tissus profonds avec une correction précise de l'aberration sphérique, ce qui permet d'obtenir des images lumineuses et en haute résolution constantes à toutes les profondeurs.
Figure 2. Schémas de contrôle de la bague de correction et de l'algorithme d'optimisation dans le système TruResolution.
a) Lorsque les bagues d'objectifs conventionnelles sont tournées, le plan focal change également (à gauche). Les objectifs TruResolution maintiennent le plan focal en modifiant automatiquement la position Z de l'objectif en fonction de l'angle de rotation (à droite)
b) Recherche de l'angle optimal de la bague de correction (θopt) : Une courbe de contraste est déterminée en calculant la valeur de contraste de chaque image acquise à différents angles de correction de la bague. La position optimale de la bague de correction est calculée en déterminant le pic de cette courbe de contraste.
Imagerie des tissus profonds en microscopie multiphotonique avec le système TruResolution
Le système TruResolution a permis des ajustements précis de la bague de correction pendant l'imagerie z-stack profonde, ce qui était auparavant difficile. Ainsi, il est désormais possible d'acquérir de façon régulière des images lumineuses et haute résolution à toutes les profondeurs.
Cela a un impact particulièrement important dans le domaine de la microscopie à excitation multiphotonique, où la résolution dépend fortement de la taille du foyer d'excitation en raison de l'absence de sténopés confocaux ou de caméras. En imagerie des tissus profonds, les signaux de fluorescence ont tendance à s'atténuer en raison de la diffusion de la lumière. Cependant, le maintien d'une petite taille de foyer d'excitation augmente la densité d'excitation, ce qui contribue à compenser la perte de signal. Par conséquent, la correction de l'aberration sphérique est d'une importance capitale tant pour la résolution que pour l'intensité de fluorescence.
La figure 3 montre les résultats de l'imagerie de billes fluorescentes incorporées dans un gel qui simule l'indice de réfraction et les propriétés de diffusion du tissu cérébral de souris. Avec le système TruResolution, la taille du foyer d'excitation reste constante quelle que soit la profondeur, et la luminosité de l'image est stable. En revanche, lorsque la bague de correction est fixée au réglage de surface, la taille du foyer augmente avec la profondeur, ce qui entraîne une réduction de la luminosité.
Figure 3. Effet du système TruResolution sur l’imagerie profonde de microbilles fluorescentes dans un gel simulant les propriétés optiques du cerveau de souris. Microbilles fluorescentes (diamètre = 200 nm) dans un gel présentant des caractéristiques optiques similaires à celles du cerveau de souris vivant (indice de réfraction : Coefficient de diffusion de la lumière : 1,36 43 cm⁻¹) excité à 960 nm avec une puissance laser constante utilisée pour toutes les images.
Rangée supérieure : Images de microbilles XZ acquises à différentes profondeurs à l'aide du système TruResolution pour la compensation automatique de l'aberration sphérique.
Rangée inférieure : Images de microbilles XZ acquises à différentes profondeurs à l'aide d'une bague de correction fixe initialement ajustée pour une imagerie optimale à la surface du gel.
Les échelles de luminosité des images sont normalisées à chaque profondeur. Toutes les images ont été acquises avec l'objectif FV30-AC25W.
Ensuite, la figure 4 montre l'imagerie in vivo des dendrites neuronales dans le cerveau de la souris à une profondeur de 400 µm. Grâce au système TruResolution, on obtient des images plus lumineuses et plus nettes, même dans des conditions d'excitation identiques.
Figure 4. Imagerie in vivo des dendrites neuronales dans le cerveau de souris vivante (souris Thy1-YFP-H, cortex sensoriel).
Les images ont été acquises à une profondeur de 400 µm en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 960 nm et l'objectif FV30-AC25W, avec une intensité d'excitation identique.
Image du haut : La compensation automatique de l'aberration sphérique par l'objectif TruResolution FV30-AC25W permet d'obtenir des images nettes et à contraste élevé des épines dendritiques.
Image du bas : Pour comparaison, le même champ de vision a été capturé avec la bague de correction optimisée pour la surface de l'échantillon, comme c'est généralement le cas avec les bagues de correction conventionnelles.
Le système TruResolution est également efficace avec des échantillons de tissus clarifiés. Dans les échantillons de tissus clarifiés, l'indice de réfraction peut varier considérablement selon les réactifs utilisés, ce qui peut affecter les performances optiques. Par exemple, l'objectif XLPLN10XSVMP prend en charge une plage d'indices de réfraction de 1,33 à 1,52. Cependant, si la bague de correction n'est pas correctement réglée, des aberrations peuvent survenir, entraînant une dégradation de la qualité d'image.
Avec le système TruResolution, la bague de correction peut être réglée automatiquement, même pour des échantillons éclaircis, permettant une imagerie lumineuse et haute résolution de façon constante.
La figure 5a montre une image XZ z-stack acquise à partir d'un cerveau de souris éclairci avec ScaleA2, observé jusqu'à une profondeur d'environ 4 l mm . Grâce au système TruResolution, des images lumineuses et uniformes ont été obtenues même dans les régions profondes. Notamment, lorsque l'indice de réfraction du milieu d'immersion correspond à celui de l'échantillon, un seul réglage de la bague de correction est nécessaire.
La figure 5b présente une image XY à une profondeur de 2,7 mm, où l'image acquise avec le système TruResolution est sensiblement plus lumineuse et plus nette que celle obtenue avec un réglage fixe de la bague de correction.
Figure 5. Système TruResolution pour échantillons de cerveau de souris clarifiés.
Des échantillons de cerveau de souris ont été clarifiés à l'aide du protocole ScaleA2. L’image de gauche a été obtenue grâce à un réglage automatique de la bague de correction utilisant le système TruResolution, tandis que l’image de droite a été obtenue par un réglage manuel de cette dernière basé sur l’indice de réfraction du réactif de clarification CUBIC. L'intensité de l'excitation était identique dans les deux conditions. Longueur d'onde d'excitation : 960 nm ; lentille d'objectif : FV30-AC10SV.
a) Projection d’intensité maximale d’une section de 250 µm d’épaisseur le long de l’axe Y après acquisition Z-stack.
b) Projection d'intensité maximale d'une section de 100 µm d'épaisseur à une profondeur de 2,7 mm le long de l'axe Z.
Imagerie à haute résolution en microscopie confocale à balayage laser utilisant le système TruResolution
En microscopie confocale à balayage laser, des variations de l'épaisseur du couvre-objet peuvent provoquer une aberration sphérique, ce qui rend difficile l'obtention d'images à haute résolution. Si la bague de correction n'est pas correctement ajustée, les images peuvent apparaître floues et sombres, ce qui réduit considérablement la précision de l'observation.
La plateforme de microscope inversé IXplore IX85 est dotée d'une unité motorisée pour le réglage de la bague de correction, compatible avec la plupart des objectifs Evident équipés d'une bague de correction et conçus pour les microscopes inversés. En changeant d'objectifs en fonction du but de l'observation, le système peut être utilisé de manière flexible dans le cadre du système TruResolution.
La figure 6 montre des images XYZ acquises par imagerie Z-stack d'une tranche de cerveau de souris éclaircie avec RapiClear. Lors de l'utilisation du système TruResolution, la résolution des axes XY et Z est améliorée, ce qui donne des images plus lumineuses et plus nettes.
Figure 6. Imagerie confocale d'une tranche de cerveau de souris éclaircie avec RapiClear 2.
Une pile Z de 27 images a été acquise à des intervalles de 0,85 µm à l'aide de l'objectif LUPLAPO25XO (NA 1,0, WD 1 mm). Les images affichées comprennent des projections d'intensité maximale (MIP) du plan XY et des vues en coupe dans les plans XZ et YZ. Magenta : Noyaux colorés au DAPI. Vert : Neurones marqués à la GFP.
a) Image acquise avec réglage automatique de la bague de correction à l'aide du système TruResolution.
b) L'image a été capturée avec la bague de correction complètement tournée dans la direction de l'indice de réfraction le plus faible. Cette condition correspond au scénario dans lequel la bague de correction est maintenue et tournée lors de l'installation de l'objectif sur le porte-objectifs rotatif.
Ces résultats confirment que le réglage automatique de la bague de correction grâce au système TruResolution permet l'acquisition d'images plus lumineuses et à plus haute résolution.
Conclusion
This white paper detailed the automated spherical aberration correction technology provided by the TruResolution system, along with its demonstrated effectiveness. Traditionally, adjusting the correction collar during deep tissue imaging or when working with cleared samples has posed significant challenges, often resulting in inconsistent image quality and complex operation.
The TruResolution system fundamentally resolves these issues through a suite of integrated features: motorized control of the correction collar, automated maintenance of the focal position, intelligent determination of optimal correction settings, and full compatibility with Z-stack imaging.
As the demand for deeper imaging and adaptation to diverse sample conditions continues to grow, the TruResolution system is expected to serve as a core technology that supports high-precision and highly reproducible imaging—greatly expanding the possibilities of microscopic observation.
Conclusion
Ce livre blanc a détaillé la technologie de correction automatique de l'aberration sphérique fournie par le système TruResolution, ainsi que son efficacité démontrée. Traditionnellement, l'ajustement de la bague de correction lors de l'imagerie des tissus profonds ou du traitement des échantillons clarifiés a posé des difficultés importantes, entraînant souvent une qualité d'image incohérente et une complexité d'utilisation.
Le système TruResolution résout fondamentalement ces problèmes grâce à un ensemble de fonctionnalités intégrées : contrôle motorisé de la bague de correction, maintenance automatisée de la position focale, détermination intelligente des réglages de correction, et compatibilité totale avec l’imagerie Z-stack.
À mesure que la demande pour des imageries plus profondes et l’adaptation à des conditions d’échantillons variées continue de croître, le système TruResolution devrait s’imposer comme une technologie de base permettant une imagerie de haute précision et de grande reproductibilité - élargissant considérablement les possibilités d’observation microscopique.
Auteur
Hiromi Utsunomiya
Imagerie haut de gamme dans le domaine des sciences de la vie, gestion de produit, Evident
Remerciements
Les images d'application ont été acquises au Centre de Collaboration Ouverte RIKEN CBS-EVIDENT, grâce à l'aimable autorisation du Dr Hiromu Monai, du Dr Hajime Hirase et du Dr Atsushi Miyawaki.
Références
Pour plus d'informations sur les études mentionnées dans ce livre blanc, veuillez consulter l'article suivant :
1. Ue, Y., Monai, H., Higuchi, K., et al. “A Spherical Aberration-Free Microscopy System for Live Brain Imaging.” Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, Vol. 500, 236–241.
Solutions pour les sciences de la vie
FV5000
Microscope confocal à balayage laser
- Clarté, rapidité et fiabilité extraordinaires, portées par des innovations de rupture.
- Les détecteurs SilVIR™ offrent une quantification photonique, une sensibilité exceptionnelle et un rapport signal/bruit ultra-élevé.
- Une plage dynamique inégalée capture l'intégralité du spectre du signal et empêche la saturation.
- Balayage résonant 2K haute vitesse et balayage galvanométrique 8K haute densité sur une seule plateforme
- Le logiciel FLUOVIEW Smart™ simplifie l'utilisation grâce à des commandes intuitives et une automatisation basée sur l'IA.
- La bague de correction automatique TruResolution™ optimise la mise au point pour plus de 20 objectifs.
- La conception modulaire prend en charge jusqu'à 10 lignes laser et les futures mises à niveau multiphotoniques.
- Le moniteur de puissance laser (LPM) garantit un éclairage stable et des résultats reproductibles dans le temps.
FV5000MPE
Microscope multiphotonique à balayage laser
- Les lasers compacts à sortie fibre facilitent l'imagerie quantitative et en profondeur des tissus fortement diffusants.
- Excitation laser multiphotonique simultanée à une, deux ou trois lignes pour une imagerie atteignant plusieurs millimètres de profondeur
- Les technologies SilVIR™, TruAI et TruSight™ offrent un rapport signal/bruit exceptionnel et une clarté exceptionnelle.
- Objectifs optimisés pour MPE, collier d’auto-correction TruResolution™ et alignement automatisé du laser IR garantissent une mise au point nette.
- Disponible en tant que mise à niveau du système FV5000 ou comme système MPE complet
- Des configurations laser entièrement réglables sont disponibles pour des applications multiphotoniques plus avancées.