La riproducibilità nella microscopia confocale non dipende solo dalla preparazione del campione e dalla tecnica dell’utente. Le prestazioni dello strumento, la stabilità dell’illuminazione, la sensibilità di rilevamento, le impostazioni di acquisizione e la raccolta dei metadati possono variare da una sessione all’altra.

Queste variabili sono particolarmente difficili da controllare nelle strutture di imaging condivise, dove più ricercatori con diversi livelli di esperienza utilizzano lo stesso strumento. Un approccio più coerente e " " inizia con l’identificazione delle condizioni soggette a variazione e con l’avvicinamento delle relative misurazioni e controlli allo strumento stesso.

Per una spiegazione più approfondita e una valutazione pratica della struttura, scarica il white paper «Garantire la riproducibilità confocale prima che gli utenti utilizzino il microscopio».

Perché la riproducibilità è difficile nelle strutture di imaging condivise

La riproducibilità è difficile nelle strutture di imaging condivise perché utenti diversi, condizioni variabili dello strumento e metadati incompleti possono tutti influenzare l’immagine finale. Il personale della struttura deve supportare ricercatori con diversi livelli di esperienza, ma non può osservare ogni decisione di configurazione né verificare ogni condizione di acquisizione in tempo reale.

Uno studio britannico del 2022, citato nel white paper scaricabile, ha rilevato un’ampia variabilità nella gestione delle strutture centrali, con lo stesso personale composto da due persone responsabile di un numero di utenti che va da 20 a 280. Ciò rende difficile la supervisione manuale, in particolare quando la variabilità potrebbe non diventare evidente fino a quando le immagini non vengono confrontate tra sessioni, utenti o lotti di campioni.

La sfida relativa alla documentazione è altrettanto significativa. Una revisione del 2020 su 240 articoli di ricerca, citata anch’essa nel documento, ha rilevato che solo il 17,7% degli articoli sulla microscopia a fluorescenza soddisfaceva gli standard minimi per la segnalazione dei parametri di acquisizione e dei metadati delle apparecchiature. Dettagli importanti possono quindi mancare dalla documentazione pubblicata anche quando le immagini risultanti appaiono idonee all’analisi.

La riproducibilità inizia prima ancora che venga acquisita la prima immagine. Dipende dalla capacità del sistema di misurare e controllare le condizioni che determinano l’immagine, anziché affidarsi interamente alla memoria, alla formazione e alla documentazione manuale dell’utente.

Perché la potenza del laser e le impostazioni del software non sono sufficienti

Le percentuali indicate dal software descrivono un’impostazione selezionata, non necessariamente la quantità di potenza laser erogata al campione. Un registro di sessione che riporta un’impostazione del laser al 10% documenta la posizione del selettore, ma non conferma quanta illuminazione abbia raggiunto il campione durante l’acquisizione.

Uno studio, citato nel white paper scaricabile, ha descritto una variazione della potenza del laser fino a 50 volte tra sistemi confocali dello stesso fornitore. Secondo lo stesso rapporto, nel corso di una singola sessione di tre ore, i laser a stato solido presentano comunemente fluttuazioni comprese tra il 25% e il 50%.

La stessa impostazione software può quindi corrispondere a condizioni di illuminazione diverse tra uno strumento e l’altro o da una sessione all’altra. Per l’imaging quantitativo, una percentuale registrata non è sufficiente a spiegare una differenza di intensità. La domanda rilevante non è solo quale impostazione abbia selezionato l’utente, ma quale potenza lo strumento abbia effettivamente erogato al momento dell’acquisizione.

Questa distinzione è il punto di partenza per la riproducibilità a livello di strumento: separare il comando software dalle prestazioni misurate dello strumento.

Perché la riproducibilità deve spostarsi a livello dello strumento

La riproducibilità dovrebbe spostarsi a livello dello strumento perché le strutture condivise non possono fare affidamento esclusivamente sulla formazione degli utenti e sulla supervisione manuale per controllare ogni condizione che influisce su un’immagine. Anche la manutenzione ordinaria del microscopio e i controlli per confermare che il sistema funzioni entro i parametri previsti comportano un notevole dispendio di tempo per il personale della struttura.

Il controllo di qualità a livello dello strumento può supportare diverse fasi del processo di imaging:

• Illuminazione: un sistema di monitoraggio della potenza del laser può misurare l’emissione del laser rispetto a un valore di riferimento di installazione e supportare la correzione quando la potenza erogata varia.
• Prestazioni dello strumento: un sistema di monitoraggio delle prestazioni del microscopio può valutare la potenza del laser, la sensibilità di rilevamento e le prestazioni di imaging a intervalli programmati.
• Rilevamento: il rilevamento con risoluzione fotonica può fornire una base più affidabile per il confronto dell’intensità tra una sessione e l’altra, quando la configurazione ottica rimane costante.
• Configurazione del flusso di lavoro: gli strumenti automatizzati possono aiutare a standardizzare il posizionamento del campione, la messa a fuoco, la regolazione della potenza del laser e le impostazioni di avvio per gli utenti che si alternano.

Qualsiasi variazione introdotta in uno qualsiasi di questi livelli può propagarsi nei dati risultanti, anche quando le altre condizioni sono ben controllate. Nel loro insieme, queste funzionalità possono garantire condizioni di acquisizione che rimangono comparabili tra le diverse sessioni e tra gli utenti che utilizzano lo stesso sistema.

In che modo il FLUOVIEW™ FV5000 supporta l’imaging riproducibile?

Il microscopio confocale a scansione laser Evident FLUOVIEW™ FV5000 supporta l’imaging riproducibile attraverso la quantificazione del conteggio dei fotoni, la correzione della deriva del laser, il monitoraggio programmato delle prestazioni e strumenti automatizzati per il flusso di lavoro in configurazioni compatibili.

I suoi rilevatori SilVIR™ supportano la quantificazione a livello di fotone, mentre il Laser Power Monitor aiuta a mantenere una potenza laser costante tra una sessione e l’altra. Il Microscope Performance Monitor valuta la sensibilità del sistema e la coerenza dell’imaging, aiutando il personale della struttura a identificare eventuali variazioni nelle prestazioni dello strumento in pochi minuti. Il software FLUOVIEW Smart™ fornisce strumenti automatizzati in grado di semplificare la configurazione di routine per utenti con diversi livelli di esperienza.

Scopri di più sul software FLUOVIEW Smart e sul suo approccio ai flussi di lavoro confocali intuitivi e potenziati dall’intelligenza artificiale.

Per approfondire come SilVIR supporti l’imaging confocale quantitativo, leggi il white paper: Sistema di rilevatori SilVIR di nuova generazione per il microscopio confocale laser FLUOVIEW FV5000.

Costruire una base di riproducibilità più solida

La riproducibilità confocale dipende dal controllo delle condizioni che determinano un’immagine, non solo dalla revisione dell’immagine dopo l’acquisizione. L’emissione laser, il comportamento del rilevatore, le prestazioni ottiche, le decisioni relative alla configurazione e i metadati contribuiscono tutti alla documentazione associata a un esperimento.

L’automazione a livello di strumento può integrare la calibrazione, il monitoraggio delle prestazioni, la configurazione dell’acquisizione e la generazione di report nel flusso di lavoro di base. Per le strutture di imaging condivise, tale approccio può aiutare i ricercatori a lavorare con maggiore sicurezza da una sessione all’altra, fornendo al contempo ai responsabili della struttura prove più chiare quando un’immagine o un esperimento richiede un’indagine.

Scarica il white paper “Garantire la riproducibilità della microscopia confocale prima che gli utenti utilizzino il microscopio” per scoprire come questi livelli interagiscono tra loro e valutare la tua struttura con la checklist di preparazione in otto punti.