Modalità di rimozione della sfocatura dell'immagine in campioni spessi senza applicazione della confocale
Sezioni organotipiche di cervelletto murino recuperate per 7 giorni dopo la demielinizzazione. Gli assoni vengono visualizzati con il neurofilamento-H in verde, la mielina è marcata con la proteina basica della mielina in rosso e i corpi cellulari degli oligodendrociti sono marcati con GSTpi in blu. Campioni di Katherine Given, MS, Università di Colorado Denver. Immagine acquisita a 20X sullo scanner per vetrini SLIDEVIEW VS200 con il modulo VS-SILA.
I microscopi grandangolari a fluorescenza offrono immagini ad alta risoluzione per campioni di spessore ridotto, ma quando devono scansionare campioni più spessi si trovano a essere soggetti a limitazioni per via della sfocatura dell'immagine causata dalla fluorescenza di sfondo.
Quindi, come è possibile rimuovere la sfocatura dell'immagine nei campioni di maggiore spessore? La risposta è il sezionamento ottico, un metodo che è in grado di superare in modo efficaci le limitazioni dell'acquisizione grandangolare, ma che tradizionalmente richiede un sistema confocale o un software di rimozione della sfocatura.
Oggi, la tecnologia di sezionamento ottico è incorporata negli scanner per vetrini di ricerca. Ciò significa che i ricercatori possono beneficiare dell'uso della confocale per ottenere immagini di campioni di elevato spessore, con importanti vantaggi dal punto di vista della produttività. In questo articolo scopriamo nel dettaglio i vantaggi del metodo di sezionamento ottico rispetto alle tecniche tradizionali.
Quali sono le limitazioni dell'acquisizione grandangolare di immagini per i campioni di elevato spessore?
La microscopia grandangolare è una tecnica comune di acquisizione di immagini, molto efficace nel caso dei campioni di ridotto spessore (<10 µm), che prevede che la fotocamera riceva la luce proveniente sia dai piani a fuoco sia fuori fuoco. Questo non è un problema nel caso di campioni sottili, ma in quelli di maggiore spessore l'inevitabile fluorescenza di sfondo causa la sfocatura dell'immagine e un contrasto insufficiente, oscurando le strutture di interesse.
Questo problema può essere risolto grazie alla microscopia confocale e ad altri metodi di illuminazione della scansione che creano uno schema di illuminazione fisso e consentono in tal modo di ottenere un'immagine sezionata otticamente. Si tratta di sistemi in grado di produrre immagini eccellenti in condizioni favorevoli, ma che allo stesso tempo sono molto costosi; essi dipendono inoltre dall'esistenza sul campione di schemi di illuminazione ben definiti e controllati.
Introduzione di un diverso approccio di illuminazione per l'acquisizione di immagini di campioni di elevato spessore
Per contrastare gli effetti della fluorescenza di sfondo sul contrasto e la qualità dell'immagine, non è sempre necessario utilizzare schemi di illuminazione ben definiti e controllati. Una tecnica, che prende il nome di microscopia HiLo, utilizza infatti schemi casuali di tipo speckle per illuminare il campione fluorescente; tali schemi presentano un'intensità granulare con un contrasto inerentemente elevato, per cui le immagini a fluorescenza ottenute tramite illuminazione speckle appaiono granulari. È proprio questa granularità a fornire contrasto, nonché un'indicazione diretta della messa a fuoco del campione.
Durante l'imaging HiLo vengono acquisite ed elaborate due immagini grezze: la prima è una normale immagine grandangolare con illuminazione uniforme, su cui viene applicato un filtro passa-alto per l'estrazione delle informazioni ad alta frequenza. Questa è la parte "Hi" della microscopia HiLo. In questa fase vengono eliminate le informazioni a bassa frequenza, tra cui quelle relative alla messa a fuoco e alla sfocatura.
La seconda immagine viene acquisita utilizzando l'illuminazione speckle per recuperare le informazioni sull'immagine a fuoco a bassa frequenza; in altre parole, si tratta della parte "Lo" della microscopia HiLo. Queste immagini vengono elaborate utilizzando un algoritmo che estrae le informazioni di messa a fuoco ed elimina la fluorescenza di sfondo. Le due immagini vengono quindi fuse insieme (Figura 1) per l'acquisizione di un'immagine contenente informazioni sull'intera gamma di frequenza, con la luce fuori fuoco rimossa.
Il dispositivo di sezionamento ottico VS-SILA è una soluzione di acquisizione di immagini ad alte prestazioni per i nostri scanner per vetrini SLIDEVIEW™ VS200 basata sulla microscopia HiLo. Si tratta di una tecnologia aggiuntiva per i microscopi grandangolari che elimina la luce fuori fuoco e che, in particolare, produce un sezionamento ottico nitido, analogo a quello della microscopia confocale. Il dispositivo VS-SILA può essere facilmente aggiunto a qualsiasi sistema VS200 e introduce vantaggi per un'ampia gamma di applicazioni che richiedono l'acquisizione di immagini ottiche di alta qualità di campioni di maggiore spessore.
Sezionamento ottico regolabile utilizzando un unico parametro.
Poiché il dispositivo VS-SILA elabora matematicamente le due immagini, quella grandangolare tradizionale e quella speckle, è possibile regolare il grado di sezionamento ottico utilizzando un unico parametro, lo spessore di sezionamento (Sectioning Thickness, ST). Quanto il parametro ST è impostato su alto, le immagini offrono informazioni con un'elevata profondità di campo, per cui ricordano le immagini grandangolari.
La Figura 2 mostra una sezione di cervello acquisita a ST5. Con un valore ST così elevato vi sono diverse aree fuori fuoco; riducendo il valore ST, l'immagine mostra invece informazioni con una profondità di campo minore. Per questo motivo, quando si osserva la sezione di cervello acquisita a ST2 e ST1, le informazioni a fuoco sono presenti mentre quelle fuori fuoco sono scomparse.
La capacità di ottimizzare in questo modo il sezionamento ottico consente la visualizzazione a diverse profondità nonché la rimozione della fluorescenza di sfondo. Questa caratteristica del dispositivo VS-SILA per lo scanner VS200 è paragonabile ai sistemi di microscopia confocale, in cui la modifica delle dimensioni del foro stenopeico può avere un effetto simile.
Rimozione della sfocatura in campioni di spessore elevato: confronto tra imaging VS-SILA e altre tecniche
Precedentemente allo sviluppo del dispositivo VS-SILA, gli scanner VS200 disponevano di una soluzione alternativa per la rimozione della luce fuori fuoco da immagini grandangolari. Utilizzando il software di deconvoluzione TruSight™ è possibile deconvolvere immagini utilizzando algoritmi 2D di tipo Constrained Iterative (CI). Pur riuscendo a offrire buoni risultati nella rimozione di una certa quantità di luce fuori fuoco, questo approccio basato su software non è in grado di raggiungere lo stesso livello né di fornire l'ottimizzazione di sezionamento ottico del software e dell'hardware combinati nel modulo VS-SILA.
La deconvoluzione rappresenta tuttavia un'utile opzione intermedia per la visualizzazione di campioni di spessore ridotto nei casi in cui non si possa ricorrere al sezionamento ottico VS-SILA. Le differenze in termini di qualità tra immagini grandangolari convenzionali, con deconvoluzione software e VS-SILA sono riportate nella Figura 3.
Applicazioni dell'imaging VS-SILA: da strati cellulari di elevato spessore a campioni tessutali
La tecnologia di sezionamento ottico VS-SILA è in grado di apportare un valore significativo a numerose applicazioni di ricerca, in particolare per l'acquisizione di immagini di campioni tessutali e di strati cellulari di elevato spessore fissati. Grazie a funzionalità di ottimizzazione del sezionamento, oltre a un'eliminazione della sfocatura e un contrasto dell'immagine comparabili rispetto a quelli dei microscopi confocali, VS-SILA offre immagini di elevata qualità con prestazioni notevolmente migliorate.
La capacità di acquisire immagini di campioni di elevato spessore rappresenta un vantaggio per l'imaging in ambito neuroscientifico, dove sezioni tessutali di questo tipo sono spesso necessarie per preservare la morfologia del campione. L'acquisizione di immagini delle sezioni cerebrali è notoriamente difficoltosa, in particolare per via della propensione del tessuto cerebrale a produrre un effetto di diffusione della luce.
Tradizionalmente sarebbero necessari sistemi di microscopia confocale o a due fotoni per acquisire un'immagine di alta qualità e ad elevato contrasto, tuttavia tali sistemi dovrebbero impiegare un lasso di tempo considerevole per l'acquisizione di un'area di grandi dimensioni come una sezione cerebrale. La scansione automatica del vetrino fornita dal sistema VS200 con il dispositivo VS-SILA rende l'imaging di aree estese di campioni di elevato spessore molto più rapido, ottenendo così immagini di elevata qualità in una frazione del tempo (Figura 4).
L'acquisizione di immagini VS-SILA porta benefici anche alla ricerca sugli organoidi, in quanto anche questo campo presenta difficoltà simili alle neuroscienze: devono infatti essere acquisite immagini di campioni di elevato spessore e su aree estese per riuscire a valutare correttamente la morfologia degli organoidi.
In quanto scanner di vetrini interi, il sistema VS200 con il modulo VS-SILA è in grado di fornire la copertura necessaria per l'acquisizione di immagini di campioni di grandi dimensioni. La sua funzione di diffusione del punto (Point Spread Function, PSF) di elaborazione automatica delle immagini indipendente dal campione e il facile flusso di lavoro consentono di ottenere risultati rapidi di acquisizione delle immagini. Il dispositivo VS-SILA è utile in diversi ambiti, tra cui ricerca oncologica, spatial biology, botanica, embriologia e molte altre applicazioni in cui è necessario acquisire immagini di campioni di spessore elevato su aree estese.
Informazioni salienti sull'acquisizione di immagini con VS-SILA
L'acquisizione di immagini con VS-SILA è in grado di ottimizzare il sezionamento ottico, ridurre la sfocatura del campione e migliorare il contrasto dell'immagine rispetto a sofisticati microscopi confocali a scansione laser. Offrendo una produttività notevolmente migliorata rispetto ai sistemi confocali, lo scanner per vetrini VS200 con dispositivo VS-SILA consente la rapida acquisizione di immagini di campioni di grandi dimensioni e tradizionalmente difficili da analizzare, a beneficio di ambiti come le neuroscienze, la ricerca sugli organoidi e simili.
Vorresti saperne di più sul funzionamento del dispositivo VS-SILA? Contattaci per sottoporci eventuali domande o per programmare una dimostrazione!
Product Manager
Alec De Grand è Product Manager in Evident nell'ambito delle scansioni virtuali di vetrini e dei microscopi verticali per il settore delle scienze della vita. Lavora in Evident da oltre 10 anni, periodo durante il quale ha gestito prodotti clinici, iniziative di marketing, corsi sull'acquisizione di immagini e fiere.