새로운 Fucci(CA) 응용 개발: 세포 주기 시각화를 위한 형광 프로브

Fucci(형광 유비퀴틴화 기반 세포 주기 지표)는 살아있는 세포 주기 모니터링을 위한 두 개의 형광 센서의 유전적으로 암호화된 세트입니다. 2017년에 새로 개발된 Fucci(CA)는 세포 주기 의존적 방식으로 mCherry(빨간색) 또는 mVenus(파란색)으로 핵을 표지합니다. Fucci(CA)는 G1 위상의 종료 시 빨간색 형광이 갑자기 감소되면 G1 위상 전체에 걸쳐 mCherry의 풍부한 발현을 산출합니다. Fucci(CA)를 사용하여 짧은 G1 위상을 확실하게 검출하고 S 및 G2 위상을 구별할 수 있습니다. 이전에는 이러한 기능을 달성하기 어려웠습니다.

Fucci(SA)

Fucci(CA)

그림1: Fucci(SA) 및 Fucci(CA)에 의한 세포 주기 진행의 시각화

낮은 광독성, 미분화 ES 세포의 타임 랩스 이미지 획득

미분화 배아 줄기(ES) 세포는 빠르게 증식하며 매우 섬세합니다. 타임 랩스 촬영 이미징 수행 중 광독성이 ES 세포를 손상시키고 증식 속도를 감소시킬 수 있으며, 이로 인해 생리학적으로 정확한 조건에서 ES 세포의 타임 랩스 이미징을 수행하기 어려울 수 있습니다. FV3000 현미경은 매우 효율적인 광경로 및 고감도 검출 장치로 인해 매우 낮은 레이저 파워를 사용하여 광독성이 낮은 타임 랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. FV3000의 이러한 속성을 통해 연구 그룹은 57시간 동안 타임 랩스 촬영 이미징 실험을 수행할 수 있었으며 빠르게 분열되는 미분화 ES 세포의 세 가지 정상 세포 주기가 완전히 적용되었습니다.

그림 2: Fucci(CA) 2.1로 표지된 쥐 ES 세포의 타임랩스 촬영 관찰

이미징 조건
표본: 쥐 ES 세포
대물렌즈: 실리콘 이멀젼 대물렌즈(UPLSAPO30XS)
현미경: FLUOVIEW FV3000 시스템
레이저: 445nm(AmCyan), 594nm(mCherry)

짧은 G1 위상의 검출

Fucci(CA)는 강력한 빨간색 신호로 G1 위상을 완전히 표지하며 이를 통해 미분화 ES 세포가 빠르게 증식하는 경우에도 위상 경계의 정확한 측정을 수행할 수 있습니다. 단세포 레벨의 타임 랩스 관찰을 통해 쥐 ES 세포(mESCs)가 약 11시간의 배가 시간과 1시간만의 G1 위상으로 증식되는 것이 밝혀졌습니다.

그림 3: Fucci(CA) 2.1 발현 단세포 핵의 형광 강도(F.I.)의 시간 프로필

FV3000의 기능을 통해 이 실험을 수행할 수 있었습니다

전체 스펙트럼 시스템이 고감도를 제공합니다

FV3000 시리즈는 VPH(Volume Phase Holographic)기술을 사용하여 투과되는 빛을 회절시키는 Olympus의 TruSpectral 검출 기술을 이용합니다. 이 기술은 반사 유형 격자가 장착된 기존 스펙트럼 검출 장치와 비교하여 빛 처리량이 훨씬 더 높습니다.

낮은 여기광 하에서 높은 신호 대 잡음비(S/N)

FV3000의 고감도 검출기 장치에는 최대 45%의 양자 효율로 약한 형광 신호를 캡처하는 GaAsP 광전자 증배관(PMT)의 채널이 최대 4개가 있습니다. 또한 이들 검출기의 펠티어 냉각을 통해 백그라운드 노이즈가 20% 감소됩니다. 동시에 이들 특징에 따라 낮은 여기광 하에도 높은 신호 대 잡음비의 이미징 수행이 가능합니다.

생리학적으로 정확한 세포 주기 이미지 획득: Dr. Asako Sakaue-Sawano의 견해

미분화 mESC는 3차원(3D) 세포 배양 공간에서 분열 및 이동하며 XYZT 이미징이 증식을 모니터링하도록 요구합니다. 타임 랩스 이미징 수행 중 반복된 레이저 스캐닝은 광독성에 대한 높은 민감성으로 인한 미분화 mESC의 세포 주기 변화를 잠재적으로 유도할 수 있습니다. FV3000 현미경 시스템을 통해 Dr. Asako Sakaue-Sawano와 동료들은 부드러운 4차원(XYZT) 이미징 실험을 수행하여 단세포 레벨에서 빠르게 증식하는 쥐 ES 세포의 매우 짧은 G1 위상을 통해 전체 세포 주기의 특징을 정확히 규정할 수 있었습니다.

감사의 말
이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
세포 기능 동역학 실험실, RIKEN 뇌과학 센터(Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Center for Brain Science)

참고문헌
이 애플리케이션 노트에 언급된 연구에 대한 자세한 내용은 다음 글을 참조하십시오.
A. Sakaue-Sawano, et al. “Genetically Encoded Tools for Optical Dissection of the Mammalian Cell Cycle.” Molecular Cell, volume 68, issue 3 (October 2017): pp. 626–640.e5.