TruResolution™ 自动球面像差校正，适用于高分辨率深层组织成像

近年来，生命科学领域的显微镜成像技术发展迅猛，与此同时，深层组织结构的高分辨率成像需求也在不断增长。但深层成像经常受光学像差影响，尤其是球面像差，导致显著降低图像质量。因此，精确校正这种像差显得无比重要。

此白皮书详细介绍 TruResolution™ 自动球面像差校正系统为 FLUOVIEW™ FV5000 共聚焦显微镜和 FV5000MPE 多光子激光扫描显微镜带来的技术创新和优势。本白皮书重点讨论 TruResolution 系统如何通过自动化和智能优化解决球面像差校正的传统挑战。

手动球面像差校正概述及面临的挑战

物镜由多个透镜元件组成，采用精密的设计和工程过程制成，可提供对细胞和细胞器等精细结构的高精度观察。这些透镜旨在抑制像差（成像误差），在理想的条件可以获得极为清晰的样本图像。

但是，如果介质（如标本或盖玻片）的折射率与浸液的折射率不同，由于光折射的缘故，导致从物镜中心进入的光线与从物镜边缘进入的光线之间的焦深出现差异。这种现象称为球面像差，会导致分辨率和荧光强度降低。

调整物镜内置的校正环可以有效地校正这种像差。旋转校正环可以补偿中心光线和周边光线之间的焦深差异，从而获得最佳成像表现。

例如，当使用水浸物镜在水中聚焦时（图 1a），如果将校正环设置为 0，可以获得最佳成像效果。相反，当通过盖玻片观察组织时（图 1b），如果不调整校正环，会产生球面像差，导致焦点扩散，从而降低分辨率和荧光强度。适当地调整校正环（图 1c）可有效地修正这种像差。

但在激光扫描显微镜中，观察通常在暗室环境下进行，导致采集图像时手动调整校正环变得非常困难。不仅如此，调整校正环还会导致焦点位置发生变化，需要经验和技巧才能获得最佳设置。

此外，在深层组织成像中，即使在靠近表面的位置调整校正环，随着观察深度的增加，球面像差仍会再次出现（图 1d）。因此，在采集 Z 轴堆叠图像时，在每个深度设置最佳校正值非常具有挑战性

Figure 1: Schematic figures of spherical aberration caused by cover glass or tissue and the effect of correction collar adjustment.

^{图 1. 示意图：盖玻片或组织导致的球面像差及校正环调整效果。}

^{a) 在理想条件下的聚焦当使用水浸物镜观察浸在水中的样本时，通过镜头中心和边缘的光线会在同一深度汇聚，不会出现球面像差。}

^{b) 存在球面像差时的聚焦。当以水为浸没介质通过盖玻片观察组织时，玻璃界面的折射会导致中心光线与边缘光线的焦深出现差异，导致产生球面像差。}

^{c) 球面像差校正后的聚焦。适当调整校正环可以补偿中心光线和周边光线之间的焦深差异，从而获得理想的聚焦条件。}

^{d) 经过表面校正后，聚焦位置会加深。如果将校正环设置为表面观察，当焦平面移动到更深处时，会再次出现球面像差，导致焦点扩散。}

利用电动校正环和自动算法优化球面像差校

TruResolution 系统支持用户使用校正环进行直观精确的调节，从而有效地克服了球面相差面临的传统挑战。

首先，为物镜配备电动校正环，用户可通过软件控制校正环，无需直接接触物镜，即使在暗室环境下也是如此，从而大大提升了操作的便利性。此外，系统还配备了一种机制，能够校正环的旋转角度自动地调整物镜 Z 轴位置。从而确保在调整校正环时焦点位置可以保持稳定，始终保持精准聚焦（图 2a）。

再者，TruResolution 还系统集成了智能算法，可以自动确定校正环的最佳位置。系统可在不同的校正环设置下采集多幅图像，并分析它们的对比度曲线，从而识别出峰值对比度点，进而高精度地计算出最佳校正值（图 2b）。用户只需在软件界面上通过一键式操作即可应用最佳校正。

在 Z 轴堆叠成像采集过程中，用户可以针对每个深度预先设置适当的校正环位置。校正环可在成像过程中自动旋转，从而确保每个焦平面上获得最佳图像质量。现在通过 TruResolution 系统，可以进行深层组织 Z 轴堆叠成像，实现精准的球面像差校正，从而在各个深度始终获得明亮、高分辨率的图像。

Figure 2: Change of focal plane by rotating correction collar. In case of conventional objective lens, focal plane changes by rotating the correction collar.

Figure 2: Finding optimum correction collar angle θopt.

^{图 2.}^{TruResolution 系统校正环控制及优化算法示意图}

^{a) 当旋转传统物镜校正环时，焦平面会同时发生变化（左图）。 TruResolution 物镜可以根据旋转角度自动调整物镜的 Z 轴位置，从而保持焦平面（右图）。}
^{b) 查找最佳的校正环角度 (θopt)：计算不同校正环角度下每张采集图像的对比度值，从而生成对比度曲线。确定该对比度曲线的峰值即可计算最佳校正环位置}

多光子显微镜检查中 TruResolution 系统的深层组织成像

TruResolution 系统可以在深度 Z-stack 成像过程中精准地调整校正环，这在以前是很难实现的。所有现在可以在所有深度稳定地采集明亮、高分辨率的图像。

由于在没有共聚焦针孔或相机的情况下，分辨率在很大程度上取决于激发光斑的大小，所以这在多光子激发显微镜中特别重要，在深层组织成像中，光散射通常会导致荧光信号发生衰减。但是，保持小的激发光斑尺寸可以增加激发密度，有助于弥补信号损失。因此，球面像差校正对于分辨率和荧光强度极为重要。

图 3 所示是将荧光微珠嵌入模拟小鼠大脑组织折射率和散射特性的凝胶中，得到的成像结果。借助于 TruResolution 系统，不同深度的激发光斑大小可以保持一致，图像亮度也可以保持稳定。相反，当表面设置中固定校正环时，光斑大小会随着深度增加而变大，导致亮度降低。

Figure 3: Fluorescent micro bead(φ200nm) in gel simulating optical characteristic of live mouse brain.

^{图 3.} ^{脑模拟凝胶中 TruResolution 系统对荧光微珠深层成像的影响。直径 200 nm 的荧光微珠分散在与活体小鼠大脑光学特性相似的凝胶中（折射率： 1.36，光散射系数： 43 cm-1），在 960 nm 波长下激发，所有图像均采用恒定的激光功率。}

^{上面行：使用 TruResolution 系统进行自动球面像差补偿，在不同深度采集的微球 XZ 图像。}
^{下面行：使用最初在凝胶表面优化调整的固定校正环，在不同深度采集的微珠 XZ 图像。}
^{每个深度的图像亮度标度进行了归一化。所有图像使用 FV30-AC25W 物镜采集。}

接下来，图 4 所示为 400 µm 深度的小鼠大脑神经元树突的体内成像。即使在相同的激发条件下，使用 TruResolution 系统仍然能够获得更明亮、更清晰的图像。

Figure 4: In vivo observation of neuronal dendrite in a live mouse brain (Thy1-YFP-H mouse, sensory cortex) acquired at 400 µm depth, with excitation at 960 nm.

^{图 4}^{. 活体小鼠大脑（Thy1-YFP-H 小鼠，感觉皮层）神经元树突体内成像。}
^{图像采集条件：深度 400 µm，激发波长 960 nm，使用 FV30-AC25W 物镜，激发强度条件相同。}

^{上部图像：利用 FV30-AC25W TruResolution 物镜的自动球面像差补偿功能采集的清晰、高对比度树突棘图像。}
^{下部图像：为进行比较，采用针对样品表面优化的校正环拍摄相同的视场，这也是传统校正环采用的常规方法。}

TruResolution 系统对透明组织样本同样有效。在透明组织样本中，折射率会因所用试剂而发生明显变化，导致影响光学性能。例如，XLPLN10XSVMP 物镜支持的折射率范围为 1.33-1.52。但是，如果校正环调整不正确，可能会产生像差，导致图像质量下降。

通过 TruResolution 系统，校正环甚至可以针对透明组织样本自动调整，从而获得始终明亮、高分辨率的成像。

图 5a 所示为采集的 Sca l eA2透明小鼠脑组织的 Z-stack XZ 图像，观察深度约为 4 mm。借助于 TruResolution 系统，即使在深层区域也能采集明亮、均匀的图像。值得注意的是，当浸液的折射率与样品的折射率一致时，校正环只需设置一次。

图 5b 所示为 2.7 mm 深度采集的 XY 图像，比使用固定校正环设置采集的图像，采用 TruResolution 系统采集的图像要明亮清晰得多。

Figure 5: Mouse brain (Thy1-YFP-H mouse）cleared with ScaleA2.

^{图 5.} ^{TruResolution 系统适合观察透明的小鼠脑组织样本。}

^{使用 Sca}^l^{eA2 对小鼠大脑样本进行透明化处理。左图通过 TruResolution 系统进行自动校正环调整采集，右图根据 CUBIC 透明试剂的折射率进行手动校正环调整采集。这两种条件下的激发强度相同。激发波长： 960 nm；物镜： FV30-AC10SV。}
^{a) Z-stack 采集后，250  µm 厚切片沿 Y 轴方向的最大强度投影。}

^{b) 100 µm 厚切片 2.7 mm 深度处 Z 轴方向的最大强度投影。}

共聚焦激光扫描显微镜通过 TruResolution 系统获得的高分辨率成像

在共聚焦激光扫描显微镜中，盖玻片厚度的变化会导致出现球面像差，从而难以获得高分辨率图像。如果未正确调整校正环，图像可能会变得模糊和昏暗，导致严重影响观察精度。

IXplore™ IX85 倒置式显微镜平台配备电动校正环驱动单元，兼容大多数配备校正环，并且配备专为倒置式显微镜设计的 Evident 物镜。该系统可以根据观察目切换物镜，可作为 TruResolution 系统的一部分进行灵活操作。

图 6所示为通过 Z-stack 成像采集的、使用 RapiClear 透明处理的小鼠大脑切片的 XYZ 图像。使用 TruResolution 系统可以同时提高 XY 轴和 Z 轴分辨率，从而采集更明亮、更清晰的图像。

^{图 6.} ^{使用 RapiClear 2 透明处理的小鼠大脑切片的共聚焦成像。}

^{使用 LUPLAPO25XO (NA 1.0, WD 1 mm) 物镜在 0.85 µm 间隔处采集的包含 27 图像 Z-stack。所显图像包括 XY 平面的最大强度投影 (MIP)以及 XZ 和 YZ 平面的横截面视图。品红色： DAPI 染色的细胞核。绿色： GFP 标记的神经元。}

^{a) 利用 TruResolution 系统自动调整校正环采集的图像。}
^{b) 图像在校正环完全旋转到最低折射率方向时拍摄。这种情况适用的场景是将物镜安装到旋转式转换器，握住并旋转校正环。}
^{这些结果证实，使用 TruResolution 系统自动调整校正环采集的图像更明亮、分辨率更高。}

结论

此白皮书详细介绍 TruResolution 系统采用的自动球面像差校正技术及其验证效果。长期以来，在进行深层组织成像或处理透明样本时，调整校正环往往会造成图像质量不稳定和操作繁琐。

TruResolution 系统采用一系列集成功能，从根本上解决了这些问题：电动控制校正环、自动维护焦点位置、智能确定最佳校正设置，以及与 Z-stack 成像的完全兼容性。

对更深层成像和适应多种样品条件的需求在不断增长，TruResolution 系统有望成为支持高精度、高度可重现性成像的核心技术，从而极大地拓展显微观察的可能性。