Anwendungshinweisen

Erkennung feiner neurovaskulärer Strukturen in der Tibia-Epiphyse mit dem Mikroskop FLUOVIEW FV3000

Imaging of Fine and Complex Tissue Structures while Reducing BleachingAufnahmen feiner und komplexer Gewebestrukturen bei gleichzeitiger Reduzierung des Ausbleichens

Die Darstellung von Blutgefäßen und sensorischen Nerven in der Epiphyse eines Kniegelenks ist schwierig, da die Nerven und Gefäße auf engem Raum eine komplexe Struktur bilden. Aufgrund seiner hohen Transmissionseffizienz ermöglicht das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV3000 eine helle, hochauflösende Abbildung feiner Strukturen bei geringer Laserstärke und reduziert so die Fotobleichung in der Probe. Dank dieser Eigenschaften des Mikroskops FV3000 konnten wir erfolgreich eine komplexe 3D-Struktur von sensorischen Nerven und den sie umgebenden Gefäßen abbilden, die ein Foramen in der tibialen Epiphyse durchdringen.

http://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/movie_neurovascular-structures_01(2)_480.mp4

Abb. 1: Sensorische Nerven und umgebende Gefäße durchdringen ein Foramen in der tibialen Epiphyse (3D-Bild)
Sensorische Nerven (EYFP, cyan), Blutgefäße (Alexa Fluor 594, magenta), Zellkerne (DAPI, orange)

Bildgebende Geräte
Mikroskop: FLUOVIEW FV3000
Objektiv: 100x Ölimmersionsobjektiv (UPLSAPO100XO)

Erkennung neurovaskulärer Strukturen in der Tibiaepiphyse

Das Verständnis der vaskulären und neuralen Projektionen des Kniegelenks ist wichtig für die Schmerzlinderung bei Kniearthropathie. Bisher konnten die feinen Strukturen von sensorischen Nerven und Blutgefäßen im gesamten Kniegelenk nicht vollständig beobachtet werden. Mit dem Mikroskop FV3000 werden diese Strukturen zum ersten Mal deutlich sichtbar. Wir stellten fest, dass sensorische Nerven im Kniegelenk nicht nur im Meniskus, sondern auch in der tibialen Epiphyse existieren. Diese sensorischen Nerven sind mit den umgebenden Blutgefäßen verschlungen und diese neurovaskuläre Struktur durchdringt zusammen ein Foramen in der tibialen Epiphyse.

Referenz: Koichi Matsuo, et al. „Innervation of the tibial epiphysis through the intercondylar foramen.” Bone, 120 (2019) 297–304

Abb. 2：Neurales und vaskuläres Foramen
Abb. 2：Neurales und vaskuläres Foramen

Vorteile des konfokalen Mikroskops FV3000 für unseren Versuch

Hochempfindlicher TruSpectral-Detektor zur Bildgebung mit geringer Fototoxizität

Der TruSpectral-Detektor besitzt ein Transmissions-Beugungsgitter, das Fluoreszenzsignale mit mehr als 40 % höherer Effizienz als herkömmliche Reflexions-Beugungsgitter übertragen kann. Aufgrund der höheren Transmission wird weniger Laserleistung zur Bildaufnahme benötigt, so dass die Fototoxizität reduziert wird.

Aufnahme von Bildern mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis bei schwachem Anregungslicht

Die GaAsP-Photovervielfacherröhre (PMT) verfügt über bis zu 4 Kanäle mit einer maximalen Quanteneffizienz von 45 %, so dass sich Proben betrachten ließen, die mit herkömmlicher Ausrüstung zu dunkel erschienen. Die Peltier-Kühlung reduziert das Hintergrundrauschen um 20 % und ermöglicht damit Bilder mit hohem Signal-Rauschabstand bei außergewöhnlich schwachem Anregungslicht.

Kommentar von Dr. Katsuhiro Kawaai

Um die feine und komplexe 3D-Struktur der Neuriten in einem engen Bereich abzubilden, war ein 100x Ölimmersionsobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur (NA) erforderlich. Problematisch war jedoch das Ausbleichen durch die konzentrierte Laserstärke. Glücklicherweise konnten wir dank der hohen Empfindlichkeit des Mikroskops FV3000 die Laserleistung niedrig halten und trotzdem hochauflösende Bilder von 50 Z-Ebenen in Intervallen von 0,45 μm aufnehmen, ohne dass es bei unserer Probe zu einem Ausbleichen kam.

Danksagungen
Dieser Anwendungshinweis wurde durch Mitwirkung folgender Forscher erstellt:
Dr. Katsuhiro Kawaai und Dr. Koichi Matsuo, Laboratory of Cell and Tissue Technology, Keio University School of Medicine

Verwendete Produkte

FV4000

Überragender dynamischer Bereich für die Bildgebung vom Makrobereich bis hin zu subzellulären Strukturen
Multiplexing von bis zu sechs Kanälen gleichzeitig mit der TruSpectral Technologie
Neu gestalteter Hochgeschwindigkeitsscanner mit hoher Auflösung für die Bildgebung von fixierten Zellen und Lebendzellen
Verbesserte Tiefenauflösung und Lichtempfindlichkeit mit bahnbrechenden NIR-Funktionen und bewährter Optik
Zuverlässiger SilVIR Detektor mit hoher Wiederholgenauigkeit
Branchenführende ^* zehn Laserlinien mit größerem Spektralbereich von 405 nm bis 785 nm

_{*Stand Oktober 2023.}

UPLXAPO

Diese erweiterten Apochromat-Objektive bieten eine hohe numerische Apertur (NA), eine breite, homogene Planität und eine Kompensation der chromatischen Aberration von 400 nm bis 1000 nm. Sie ermöglichen eine hochauflösende, helle Bilderfassung bei vielen Mikroskopieanwendungen, wie etwa bei der Hellfeld-, Fluoreszenz- und konfokalen Mikroskopie mit Superauflösung.
Hohe NA, große, homogene, verzeichnungsfreie Bilder und Kompensation der chromatischen Aberration in einem großen Bereich von 400 nm bis 1000 nm
Hoch zuverlässiges Präzisionsbild für diverse Anwendungen von der Hellfeld-/Fluoreszenzmikroskopie bis zur konfokalen/superauflösenden Mikroskopie