Jedes Jahr werden in Nature Methods die gängigsten und einflussreichsten Technologien und Ansätze ermittelt, die im vergangenen Jahr einen wichtigen Beitrag in den Life Sciences geleistet haben. 2017 wurden Organoide in Nature Methods zur Methode des Jahres ernannt. Seitdem hat die Organoidforschung dank intensiver Forschungsarbeit Früchte getragen.

Organoide sind im Grunde dreidimensionale (3D) Gewebekulturen von Gewebe- oder Stammzellen. Sie werden für sehr viele unterschiedliche Forschungsarbeiten verwendet, da es sich bei ihnen im Wesentlichen um vereinfachte und miniaturisierte Versionen von menschlichem Gewebe oder Organen handelt. Sie simulieren die physiologische Struktur und Funktion von In-situ-Gewebe sehr genau und können genetische Informationen über zahlreiche Passagen hinweg stabil beibehalten.

Aufgrund der Fähigkeit von Organoiden, Teile des menschlichen Körpers nachzuahmen, werden sie in der Forschung zum Beispiel für folgende Zwecke genutzt:

• um Einblicke in den Entwicklungsprozess von Organen zu gewinnen;
• um die Wirkung von Arzneimitteln zu testen;
• um regenerative Therapien zu entwickeln.

Dieser Blogbeitrag befasst sich mit einigen der neuesten Ergebnisse in der Organoidforschung und zeigt, wie Mikroskop-Bildgebungssysteme diese wichtige Arbeit unterstützen.

Fortschritte in der Organoidforschung

Organoide liefern immer wieder neue Forschungserkenntnisse. Hier sind einige erwähnenswerte Studien:

1. Modellierung der inter- und intratumoralen Heterogenität mithilfe eines Patienten-Glioblastom-Organoids

2019 veröffentlichten Forschende der University of Pennsylvania einen Artikel mit dem Titel „A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity“ in der Zeitschrift Cell. Darin geht es um die Entwicklung eines Modells und den Aufbau einer Biobank mit von Patienten stammenden Glioblastom-Organoiden (GBO).

Im Rahmen der Studie konnte gezeigt werden, dass das GBO die wichtigsten Merkmale des Glioblastoms beibehält und unmittelbar zur Entwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten verwendet werden kann. Die von den Forschenden eingerichtete Biobank bietet umfangreiche Ressourcen für grundlegende und translationale Studien zum Glioblastom.

Die Forschenden dokumentierten den Wachstumsprozess und die mikroskopisch festgestellten morphologischen Veränderungen des Organoids. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten sie auch die Expressionsmuster einiger Proteinmarker in dem Organoid.

Diese Arbeit zeigte die offensichtliche Heterogenität der Morphologie und der Eigenschaften der organoiden Zellen sowie ihre sehr ähnliche zelluläre Zusammensetzung im Vergleich zum Ursprungstumor.

2. Dynamik der Chromatinzugänglichkeit in einem Modell der menschlichen Vorderhirnentwicklung

2020 wurde in der Fachzeitschrift Science ein Artikel mit dem Titel „Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development“ veröffentlicht. Er beschreibt den Kulturprozess zur Herstellung und die beabsichtigte Verwendung humaner Vorderhirn-Organoide, um zu zeigen, wie humane Organoide des Vorderhirns sich selbst zu verschiedenen Teilen des Vorderhirns zusammensetzen können.

Noch interessanter ist, dass die Forschenden auch einen Weg gefunden haben, die Lebensdauer humaner Vorderhirn-Organoide auf bis zu 300 Tage zu verlängern. Dieser lange Zeitraum ist wichtig, um die Entwicklung von Vorderhirn-Organoiden zu komplexeren Strukturen beobachten zu können.

3. Amplifikation menschlicher Interneuron-Vorstufen begünstigt Hirntumore und neurologische Defekte

2022 erschien in der Fachzeitschrift „Science“ der Artikel „Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects“. Diese Studie zeigte die spezifischen humanen Entwicklungsprozesse bei Fehlbildungen bei der kortikalen Entwicklung (Malformations of Cortical Development, MCDs) auf, die zu Entwicklungsverzögerungen und Epilepsie bei Kindern führen können.

Die Forschenden erzeugten humane Hirnorganoide als Modell für tuberöse Sklerose (TSC) und identifizierten einen neuralen Stammzelltyp – CLIP (Caudal Late Interneuron Progenitor). Bei TSC vermehren sich CLIP-Zellen übermäßig, was zu einem Überschuss an Interneuronen, Hirntumoren und kortikalen Fehlbildungen führt.

Organoide sind vielversprechende Modelle für Entwicklungsstudien und für die Erforschung von Krankheiten und Arzneimittel. Auch in anderen Bereichen, beispielsweise in der regenerativen Medizin, werden immer häufiger Organoide eingesetzt. Dennoch gibt es noch viele Hürden im Zusammenhang mit der Kultivierung, Beobachtung und quantitativen Datenanalyse von Organoiden zu überwinden, da ihre Kulturansprüche und Strukturen komplexer sind als die von anhaftend wachsenden Zellen.

Dreifache Unterstützung der Organoidforschung durch mikroskopische Bildgebung

Die mikroskopische Bildgebung kann helfen, diese Schwierigkeiten zu überwinden. Im Folgenden werden drei Möglichkeiten vorgestellt, wie Mikroskop-Bildgebungssysteme und -Software die Organoidforschung voranbringen:

1. Qualitätskontrolle von Organoidkulturen

Bei der Herstellung von Organoiden werden in der Regel embryonale Zellen oder induzierte pluripotente Stammzellen isoliert und diese Zellen dann auf Trägermedien (z. B. Matrigel) kultiviert, um ihr dreidimensionales Wachstum zu ermöglichen.

Dem Medium werden Zytokine, Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle zugesetzt, um bestimmte Signalwege, die an der Bildung von Organoiden beteiligt sind, zu aktivieren oder zu hemmen. Die Signalwege sind die gleichen wie die, die auch in vivo zur Entwicklung und Aufrechterhaltung der Homöostase der entsprechenden Organe beitragen.

Forschungsarbeiten von Dr. Takanori Takebe vom Tokyo Medical and Dental University Institute of Research ergaben, dass die Effizienz der anschließenden Differenzierung in Organoide stark von Unterschieden im frühen Proliferationsstadium in der Erhaltungskultur beeinflusst wird. Er stellte fest, dass sich bei den zur Differenzierung fähigen iPS-Zelllinien aus den meisten der nach dem Passagieren im Frühstadium der Proliferation adhärenten Zellen Kolonien bildeten.

Dr. Takebe stellte die Hypothese auf, dass der häufigere Zelltod in den Frühstadien der Erhaltungskultur bei differenzierungsresistenten iPS-Zelllinien zu einer geringeren Anzahl von iPS-Zellkolonien führt, was letztlich die Effizienz ihrer Differenzierung zu Leberknospenorganoiden verringert. Die reproduzierbare Erzeugung von Organoiden erfordert daher sowohl die Entwicklung optimierter Protokolle für die Differenzierung von Organoiden als auch die Optimierung der Kultur für die ursprünglichen undifferenzierten iPS-Zellen. Um neue Erkenntnisse zu gewinnen und seine Versuchsprotokolle zu verbessern, verwendet Dr. Takebe unser Inkubationsüberwachungssystem.

Mit dem CM30 System, das zur Erfassung und Analyse von Zeitrafferdaten kultivierter Proben eingesetzt werden kann, lässt sich der Status von iPS-Zellen während der Zellkultur feststellen und es können Schlüsselfaktoren zur Steigerung der Differenzierungseffizienz identifiziert werden, um die Versuchsprotokolle weiter zu verbessern.

CM30 Inkubationsüberwachungssystem.

Aufgrund der langen Kultivierungszeit von Organoiden und der hohen Kosten für Medien und Zusatzstoffe, die zur Aufrechterhaltung ihres Wachstums erforderlich sind, müssen Organoidkulturen und ihr Wachstum besonders aufmerksam überwacht und Kontaminationen vermieden werden.

Dank der Fernüberwachungsfunktion des CM30 Systems ist ein Betreten des Reinraums zur Entnahme von Proben aus dem Inkubator für die mikroskopische Untersuchung nicht mehr notwendig. Dies erhöht die Effizienz der Versuche erheblich und verringert das Kontaminationsrisiko.

Entwicklung von Organoiden in einem Inkubator. Mit dem CM Inkubationsüberwachungssystem aufgenommene Bilder. Bildquelle: ACEL, Inc.

2. Mikroskopische Bildgebung von Organoiden

Da es sich bei Organoiden um 3D-Zellkulturen mit einem bestimmten Volumen handelt, werden Mikroskop-Bildgebungsgeräte bevorzugt, die Bildinformationen aus mehreren Schichten in der Z-Achse für die 3D-Bildgebung erfassen können. Auf diese Weise können mittels Bildgebung umfassende Informationen über die morphologischen Merkmale und die inneren Zellstrukturen von Organoiden gewonnen werden.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für die Bildgebung von Organoiden

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope sind für die Aufnahme volumetrischer 3D-Bilder eines Organoids gut geeignet. Dank der Lochblende vor dem Detektor, die den unscharfen Hintergrund ausblendet, werden nur die Informationen in der Zieltiefe mit hoher axialer Auflösung erfasst.

Mit unserem SilVIR Detektor, der ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, eine genauere Bildgebung sowie eine hohe räumliche und spektrale Auflösung bietet, sorgt unser konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV4000 für präzise Bildwiedergabe. Der SilVIR Detektor mit unserer patentierten* Technologie zur HDR-Photonenzählung liefert hochgenaue 3D-Bilddaten. Mit dieser Technologie können auch präzise 3D-Bilder rekonstruiert werden – ideal für die Untersuchung von Organoidstrukturen.

*Patentnummer US11237047.

Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FV4000.

Das FV4000 System verfügt zudem über eine bewährte Nah-Infrarot (NIR)-Lösung. Die NIR-Bildgebung sorgt für tiefe Penetration, geringe Phototoxizität und geringe Störungen durch Eigenfluoreszenz im Gewebe. Daher können verschiedene Fluoreszenzkontraste im sichtbaren Bereich eingesetzt werden, um eine überschneidungsfreie Mehrfarben-Fluoreszenzbildgebung von Organoiden zu erreichen und Organoidaktivitäten über einen längeren Zeitraum zu beobachten.

Kontinuierliche Beobachtung von kultivierten 3D-Zellkugeln über 21 Tage mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW. Der Zellkern ist mit SYTOX Orange (rot) markiert. Das Zytoskelett ist mit Alexa Fluor 488 (grün) markiert.

Multiphotonenmikroskopie für die Bildgebung von Organoiden

Zum Erhalt eines vollständigen Bildes eines großvolumigen Organoids ist eine größere Bildtiefe erforderlich. Multiphotonenmikroskope sind dazu ideal geeignet.

Hier ist ein Überblick darüber, wie diese Systeme bei der Tiefenbildgebung von Organoiden helfen können:

Unser Multiphotonenmikroskop FV4000MPE verfügt über eine besondere Optik zur Optimierung der Empfindlichkeit und Auflösung bei der Tiefenbildgebung. Im Wellenlängenbereich von 400–1600 nm ist eine effizientere IR-Anregung ohne Beeinträchtigung der Detektion im sichtbaren Wellenlängenbereich möglich.

Der optische Detektionspfad mit großer freier Apertur und hoher Effizienz unterstützt die Bündelung von mehr Emissionssignalen, insbesondere von gestreuten Photonen bei großen Einfallswinkeln. Der SilVIR Detektor im Kern des Systems sorgt zudem für außergewöhnlich geringes Rauschen und hohe Empfindlichkeit mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis über den gesamten sichtbaren Bereich bis hin in den NIR-Wellenlängenbereich.

Dank dieser optischen Ausstattung lassen sich auch Informationen tiefer im Inneren eines Organoids erfassen. TruResolution Objektive verbessern darüber hinaus die Helligkeit und Auflösung bei der Tiefenbildgebung durch automatische Kompensation sphärischer Aberration, sodass mit dieser leistungsstarken Optik detailliertere Informationen auf allen Ebenen eines 3D-Bilds erfasst werden können.

Multiphotonenmikroskop FV4000MPE für die Tiefenbildgebung von Organoiden.

Super-Resolution-Mikroskopie für die Bildgebung von Organoiden

Bei großvolumigen Organoiden stellen sich noch höhere Anforderungen an das Bildgebungssystem. Das Bildgebungssystem muss Z-Stapel-Bilder aufnehmen und die aufgenommenen Bilder zusammenfügen können, was eine Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme erfordert. Hier kommt die konfokale Mikroskopie mit Spinning-Disk-Technologie ins Spiel.

Während Laser-Scanning-Mikroskope eine Einzellochblende verwenden, wird bei der konfokalen Mikroskopie mit Spinning-Disk eine opake Scheibe mit Hunderten von Löchern eingesetzt, die sich mit hoher Geschwindigkeit dreht. So wird die gesamte Probe auf einmal und nicht Punkt für Punkt abgebildet, was die Bildgebungsgeschwindigkeit deutlich erhöht und Lichtschäden reduziert.

Unser IXplore SpinSR Super-Resolution-Mikroskop ist ein konfokales Spinning-Disk-System, das sich durch schnelle Bildgebung, hohe Empfindlichkeit, geringe Phototoxizität und skalierbare Super-Resolution-Module mit einer Auflösung von bis zu 120 nm auszeichnet. Dies sorgt insgesamt für höhere Geschwindigkeit bei der Z-Stapel-Bildgebung und beim Zusammenfügen der einzelnen Organoidbilder.

Xplore SpinSR Mikroskopsystem mit Super-Resolution-Technologie.

Das IXplore SpinSR System kann mit unseren Silikonöl-Objektiven kombiniert werden. Diese Optiken sorgen für scharfe, hochauflösende Bilder mit weniger Unschärfe, auch bei der Tiefenbildgebung von Organoiden.

Silikonöl-Objektive eignen sich für die Tiefenbildgebung von Organoiden.

Unsere Silikonöl-Objektive verwenden ein spezielles Silikonöl mit einem Brechungsindex von 1,40 als Immersionsmedium. Damit erfüllen diese Objektive die Anforderungen für die Aufnahme hochauflösender Bilder (höher als bei Wasserimmersionsobjektiven) und die Beobachtung von stark streuenden Proben wie Organoiden und anderen dicken Proben.

3. Quantitative Analyse von Organoidbildern

Bisher ging es darum, wie mit High-End-Mikroskopen, beispielsweise konfokalen Laser-Scanning-, Multiphotonen- und Super-Resolution-Mikroskopen, klare Makro- und Mikrobilder von Organoiden aufgenommen werden können. Anhand dieser Bilder kann die Feinstruktur jeder Zelle innerhalb einer 3D-Probe bis hin zur subzellulären Ebene untersucht werden.

In der Life Science Forschung ist es jedoch nicht ausreichend, nur die Details einer Probe zu beobachten. Bei Versuchen, in denen Organoidmodelle zur Validierung der Wirksamkeit und zur toxikologischen Analyse von Arzneimitteln verwendet werden, sind auch qualitative und quantitative Analysen der Morphologie des Organoids und seiner inneren Zellen erforderlich. So kann beispielsweise der Vergleich der Unterschiede zwischen mehreren Organoiden bei unterschiedlichen Medikamentendosierungen in einer Multiwell-Platte überzeugendere statistische Daten liefern.

Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, haben wir die NoviSight Zellanalysesoftware für die komplexe 3D-Zellidentifizierung und -analyse von Proben wie Zellsphäroiden oder Organoiden in Multiwell-Platten entwickelt.

Die Benutzeroberfläche der NoviSight Software. Dieses Beispiel zeigt eine quantitative Analyse mitotischer Zellen in Zellsphäroiden, die mit unterschiedlichen Paclitaxel-Konzentrationen behandelt wurden.

Zu den hilfreichen Funktionen für die Organoidforschung gehören:

• die True 3D-Zellanalysetechnologie, mit der die räumliche Morphologie der Proben realistisch reproduziert werden kann;
• ein Modul für multiparametrische Messungen, um Organoid- und Zellkomponenten schnell zu identifizieren und nützliche Daten wie Volumen, Oberfläche, räumlicher Abstand und Fluoreszenzintensität zu erhalten;
• eine interaktive Benutzeroberfläche, die eine einfache Zuordnung von Zellbildern zur jeweiligen Statistik ermöglicht, um eine genaue statistische Analyse der Daten durchzuführen.

Da Organoide die entsprechenden menschlichen Gewebe sowohl auf genetischer als auch auf morphologischer Ebene genau simulieren können, bieten sie vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für die Simulation des Entwicklungsprozesses und die Erforschung von Krankheiten, klinischer Immunität und der Medikamentenempfindlichkeit von Tumoren sowie in der regenerativen Medizin und die Präzisionsmedizin.

Dennoch darf nicht vergessen werden, dass es sich bei Organoiden noch um eine sehr junge Technologie handelt. Nach wie vor gibt es Grenzen im Zusammenhang mit der Kultivierung, der Qualitätskontrolle und der experimentellen Reproduzierbarkeit von Organoiden. Die Grundlagenforschung über Organoide und ihre Anwendung steckt nach wie vor in den Kinderschuhen, und der Weg zur Umsetzung gewonnener Erkenntnisse in die medizinische Praxis ist noch weit.

Aufgrund unserer langjährigen Erfahrungen in der Herstellung von Optiken und Mikroskopen ist Evident in besonderem Maß aufgestellt, die Organoidforschung bei diesem Prozess zu unterstützen. Durch die Bereitstellung von Komplettlösungen für die Organoidforschung – von der Probenvorbereitung bis hin zur 3D-Datenerfassung und -analyse – tragen wir gemäß unserem Leitspruch dazu bei, die Welt gesünder und sicherer zu machen.