La recherche en sciences de la vie entre dans une ère de transformation. Dans les laboratoires d'imagerie et les plateformes de recherche, les scientifiques sont confrontés à des demandes croissantes de données quantitatives à haute résolution pour répondre à des questions biologiques de plus en plus complexes. L'imagerie de précision est essentielle pour les chercheurs qui dirigent les domaines des neurosciences, de la biologie cellulaire, de la découverte de médicaments, de la recherche sur le cancer et de la biologie du développement.

Historiquement, les chercheurs ont souvent dû faire des compromis difficiles dans leurs travaux : trouver le juste équilibre entre qualité d’image et rapidité, ou privilégier la préservation des échantillons au détriment de la profondeur expérimentale. La capture de processus cellulaires délicats nécessitait de la prudence pour éviter la phototoxicité, tandis que l’imagerie en profondeur des tissus était souvent limitée par la diffusion optique ou la complexité des équipements. Même la reproductibilité de base s'est avérée un défi, de légères variations dans l'étalonnage des instruments entraînant des résultats incohérents entre utilisateurs, expériences ou laboratoires.

Avec l’introduction du microscope confocal et à balayage laser multiphotonique FLUOVIEW™ FV5000, ces barrières peuvent appartenir au passé. « Le FV5000 redéfinit les limites de la résolution, de la vitesse et de la polyvalence expérimentale », déclare Buelent Peker, Senior Product Marketing Manager chez Evident et expert reconnu en microscopie à balayage laser. « Ce qui était autrefois incroyablement difficile peut désormais devenir une routine grâce aux avancées passionnantes dans les technologies de balayage, les détecteurs et les logiciels. »

Nouvelles avancées dans le domaine des microscopes confocaux pour les sciences de la vie

Le FV5000 repose sur des avancées majeures dans le domaine de la microscopie confocale pour les sciences de la vie. Combinées, ces innovations créent une expérience d'imagerie fondamentalement différente pour les utilisateurs de tous niveaux – une expérience où la vitesse, la sensibilité et la précision quantitative fonctionnent de concert, et non l'une contre l'autre.

1. Analyse quantitative par comptage de photons

L'une des évolutions les plus transformatrices de la microscopie confocale moderne est la technologie de comptage de photons. Traditionnellement, les microscopes confocaux reposaient sur la comparaison des intensités lumineuses relatives pour déduire les différences entre les échantillons. Bien que cette méthode fournisse des informations qualitatives, elle est très sensible à des facteurs externes tels que la tension du détecteur, l’alignement, la stabilité de la puissance du laser et même les variations de température dans le laboratoire. De légères variations entre les expériences peuvent entraîner des mesures incohérentes. Cela rend les comparaisons quantitatives peu fiables, en particulier lorsqu’on tente de reproduire des résultats à différents moments, sur divers projets ou dans le cadre d’études collaboratives.

« Lorsqu’on compare les niveaux d’intensité, il y a toujours des difficultés », explique Peker. « Vous devez contrôler votre instrument avec une très grande rigueur, et vos détecteurs doivent vous fournir une sortie de comptage avec une sensibilité définie — l’amplification du signal arrivant à votre détecteur doit toujours rester la même, la puissance du laser atteignant votre échantillon doit toujours rester la même. » De plus, il faut veiller à toujours utiliser le même canal sur le système, car la sensibilité peut varier d’un détecteur à l’autre.”

Technologie de détection SilVIR™

La nouvelle référence en microscopie avancée, la technologie de détection SilVIR™ de nouvelle génération du FV5000 offre une quantification au niveau des photons qui change fondamentalement ce paradigme en détectant et en comptant les photons individuels, créant ainsi une mesure véritable et absolue de l’intensité de fluorescence plutôt qu’une estimation relative. Cela transforme la microscopie confocale en un outil quantitatif absolu, comblant le fossé entre l’imagerie qualitative et l’analyse de données reproductible.

Reproductibilité interlaboratoires

L'un des principaux avantages de l'analyse quantitative est sa reproductibilité interlaboratoires. Pour les collaborations à grande échelle ou les études de recherche multisites, une reproductibilité fiable est primordiale : le comptage de photons élimine les variables précédentes et permet aux chercheurs de différents établissements de recueillir des données directement comparables.

Pour garantir une plus grande cohérence, le moniteur de puissance laser (LPM) du FV5000 mesure et calibre automatiquement la puissance du laser en temps réel. Cela garantit que des conditions d’imagerie identiques—telles que la puissance d’excitation et la réponse du détecteur—sont maintenues lors des différentes sessions et sur l’ensemble des systèmes. Ensemble, le comptage de photons et la standardisation du LPM éliminent les principales sources de variation, permettant une véritable comparabilité quantitative.

Ceci revêt une importance capitale dans des disciplines telles que les neurosciences ou la recherche pharmaceutique, où la reproductibilité expérimentale est essentielle pour valider les résultats et garantir l'intégrité des données entre les différents sites de recherche.

Cohérence au sein des expériences

Le suivi des processus de développement ou de la progression d'une maladie nécessite une imagerie régulière sur plusieurs semaines, voire plusieurs mois. Le comptage de photons garantit des mesures cohérentes et fiables, permettant aux scientifiques de comparer en toute confiance les différents points temporels sans se soucier des problèmes d’étalonnage quotidiens.

En complément, le Laser Power Monitor (LPM) mesure et compense en continu les fluctuations de puissance laser pendant l'acquisition. Cela permet de maintenir des conditions d'excitation identiques au jour le jour, même lors d'expériences à long terme. Ensemble, le comptage des photons et la stabilité du LPM garantissent une cohérence quantitative—permettant aux chercheurs de suivre avec confiance les changements biologiques subtils.

L’élimination des suppositions

Auparavant, les scientifiques devaient consacrer un temps précieux à peaufiner les paramètres du détecteur pour éviter la saturation ou le bruit. Cela introduit à la fois des risques d'erreur humaine et une complexité accrue des flux de travail, ce qui représente un défi particulièrement important pour les utilisateurs moins expérimentés. Grâce à la technologie SilVIR du FV5000, ces réglages manuels sont éliminés, ce qui rend l'imagerie plus simple et plus fiable pour les utilisateurs de tous niveaux d'expérience.

« La quantification au niveau des photons rendue possible par le FV5000 élimine les approximations en matière d’imagerie de précision et garantit que les résultats peuvent être fiables d’un laboratoire et d’une expérience à l’autre. »

2. Sensibilité et détection à grande plage dynamique

Les échantillons biologiques présentent souvent des intensités de signal extrêmement diverses. P. ex., le soma d’un neurone peut fluorescer intensément tandis que de fins processus axonaux produisent des signaux faibles. Historiquement, les chercheurs devaient ajuster manuellement le gain ou la puissance du laser pour capturer les deux, ce qui nécessitait souvent plusieurs images à différents réglages.

Cette approche est chronophage et empêche toute comparaison quantitative directe entre les régions ou les échantillons. La plage dynamique élevée (HDR) du FV5000—la plus large du secteur—résout ce problème en capturant simultanément les signaux faibles et lumineux dans une seule image. Cela offre une sensibilité exceptionnelle, permettant aux chercheurs d'explorer toute la complexité de leurs échantillons.

« Idéalement, vous souhaitez disposer d’un détecteur très sensible et d’une large plage dynamique, toutes deux réunies dans le FV5000 », explique Peker. « Avec les systèmes traditionnels, si vous vouliez visualiser efficacement les intensités et les structures, vous deviez ajuster la tension pour mettre en évidence les parties les plus faibles — mais si vous augmentez la tension, l’amplification est différente et la plage dynamique diminue. En revanche, si vous avez des zones très lumineuses, il faut alors diminuer le niveau d'intensité. Vous vous retrouvez alors avec toutes ces augmentations et diminutions pour différentes parties du même échantillon — ce qui n'est pas idéal pour la cohérence de l'acquisition ou la comparaison d'intensité. »

Élimination des images saturées

Un autre inconvénient de l’impossibilité d’afficher simultanément des signaux faibles et lumineux est la génération d’images saturées. La saturation se produit lorsque des régions lumineuses saturent le détecteur, écrêtant les données et détruisant l'intégrité quantitative. La technologie HDR du FV5000 élimine ce risque, préservant ainsi les informations sur l’ensemble du spectre d’intensité.

« Au final, la saturation tue tout ce qui doit être analysé — il faut l’éviter à tout prix. » « Le HDR est d'une grande aide. » — Buelent Peker

3. Techniques d'imagerie et de balayage à large bande

La microscopie confocale n'est plus limitée au spectre visible : le FV5000 peut couvrir de 400 à 900 nm grâce à des lasers proche-infrarouge (NIR), permettant l'utilisation de colorants NIR (proche-infrarouge) qui offrent des avantages uniques pour la recherche en sciences de la vie.

Pénétration plus profonde des tissus

La lumière NIR se diffuse moins dans les tissus biologiques, permettant aux chercheurs d’imager plus en profondeur des structures 3D telles que des organoïdes, des embryons ou des tranches épaisses de tissu. « Avec les colorants NIR, vous pouvez aller plus en profondeur dans les tissus 3D et les échantillons épais — la profondeur de pénétration est tout simplement meilleure, avec moins de diffusion grâce à des colorants plus décalés vers le rouge », explique Peker.

Réduction de la phototoxicité

Les longueurs d’onde plus longues du FV5000 sont plus douces pour les cellules vivantes, prolongeant ainsi la viabilité des cellules lors des expériences d’imagerie cellulaire à long terme. Ceci est particulièrement précieux pour la biologie du développement et les essais de médicaments, où les cellules doivent rester saines pendant des jours, voire des semaines. Selon Peker, « Avec des colorants proches infrarouges (NIR), vous pouvez réaliser de l’imagerie de cellules vivantes beaucoup plus longtemps dans un milieu incubé — vos cellules ne mourront pas aussi rapidement en raison d’une phototoxicité moindre. »

4. Balayage galvanométrique et à résonance

Bien que précis, le balayage galvanométrique traditionnel présente des limitations de vitesse, ce qui rend difficile la capture d'événements biologiques rapides ou le balayage efficace de grands volumes de tissus. Le balayage résonant permet de relever ce défi, en augmentant considérablement la cadence d’images.

Le FV5000 combine les deux stratégies de balayage, offrant une flexibilité bimodale. Le mode Galvo peut être utilisé pour des expériences nécessitant un rapport signal/bruit maximal ou des schémas de stimulation complexes, comme l'optogénétique. Le mode résonant, idéal pour l'imagerie à haute vitesse des processus dynamiques, peut ensuite être utilisé pour des applications telles que le trafic vésiculaire, les pics de calcium ou les scans cérébraux complets à un débit plus élevé.

« La flexibilité de balayage du FV5000 garantit que les chercheurs peuvent optimiser leur imagerie pour n’importe quelle application », déclare Peker. « Avec le balayage galvanométrique et résonant disponibles sur un même système, vous pouvez facilement basculer entre les modes selon vos besoins, sans compromettre les performances ni la qualité d’image. »

5. Imagerie à haute cadence (FPS élevé)

Le FV5000 offre également une imagerie à haute cadence d’images par seconde (FPS), essentielle pour certaines tâches scientifiques. L'imagerie à haute cadence est idéale pour suivre les structures cellulaires à déplacement rapide, comme les vésicules ou les éléments du cytosquelette, et pour capturer des événements physiologiques rapides. L’imagerie à haute cadence peut également être utilisée pour réduire les temps d’acquisition lors de grands scans mosaïques XYZ, rendant les flux de travail de plusieurs heures six à dix fois plus rapides.

_{Coupe de cerveau de souris clarifiée avec SeeDB2. Neurones pyramidaux de la couche 5 du cortex, marqués EYFP, dans Thy1-YFP-H. Échantillon fourni par : Drs Satoshi Fujimoto et Takeshi Imai, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University.}

6. Technologie des lasers à fibre

L'excitation multiphotonique (MPE) est essentielle pour l'imagerie profonde de tissus épais et diffus, notamment des coupes de cerveau, des organoïdes et des embryons vivants. Les systèmes MPE traditionnels reposaient souvent sur de volumineux lasers infrarouges femtoseconde qui nécessitaient de grandes tables optiques, une climatisation spécialisée pour gérer la chaleur et du personnel technique qualifié. Ces systèmes étaient prohibitivement chers et difficiles à intégrer, ce qui signifiait que l'accès à la MPE était généralement limité aux laboratoires disposant de grands budgets et d'un personnel nombreux.

Intégrant des avancées novatrices dans la technologie des lasers à fibre, le FLUOVIEW™ FV5000MPE contribue à transformer le paysage multiphotonique, offrant à un plus grand nombre de laboratoires la possibilité d'étudier des échantillons 3D épais et des organismes vivants.

Compact et accessible

Les lasers à fibre multiphotoniques du FV5000MPE sont nettement plus petits et plus faciles à intégrer dans les systèmes existants que les lasers IR femto. Ils sont également beaucoup moins sensibles aux changements environnementaux tels que les vibrations ou les fluctuations de température.

Longueurs d'onde fixes

Les lasers à fibre du FV5000MPE peuvent fonctionner à des longueurs d’onde fixes, autour de 920 à 950 nm pour l’excitation de la GFP, offrant une utilisation simple et économique tout en couvrant la plupart des besoins courants en recherche. « Les lasers multiphotoniques couplés à fibre, fonctionnant à une longueur d’onde fixe, sont faciles à contrôler et à manipuler », explique Peker. « Vous pouvez donc décider et utiliser, disons, 925 nanomètres pour un laser MPE fixe, qui couvre votre signal le plus couramment utilisé pour la GFP lors d’études sur des animaux vivants. »

Démocratiser l'imagerie profonde

Solution abordable et facile à déployer pour l’imagerie multiphotonique de routine, le FV5000MPE rend la technologie multiphotonique plus accessible aux petits laboratoires et aux plateformes technologiques, étendant sa portée au-delà des centres de recherche d’élite. Les lasers à fibre du FV5000MPE simplifient non seulement la multiphotonique, mais améliorent également la fiabilité, aidant ainsi les chercheurs à imager des organismes vivants pendant de longues périodes sans les complications des systèmes traditionnels.

« Avec le FV5000MPE, la technologie multiphotonique est plus accessible, moins chère et plus facile à intégrer dans les laboratoires », déclare Peker. Les récents développements nous ont permis de créer un système MPE compact, facile à utiliser et à mettre à niveau.

« Les lasers à fibre optique ouvrent la voie à l’imagerie des tissus profonds pour des laboratoires qui n’en avaient jamais eu les moyens auparavant. » « Il s’agit d’une étape majeure vers la démocratisation de la technologie MPE. » — Buelent Peker

^{Cellules HeLa cultivées exprimant Lifeact-mScarlet-I et EB3-3xmNeonGreen. Échantillon fourni par : Haruka Mii et Professeur Kazuhiro Aoki, École supérieure de sciences biologiques, Kyoto University. Pour en savoir plus sur l'origine des cellules HeLa, consultez henriettalacksfoundation.org.}

Un tournant technologique

Le nouveau FV5000 représente un tournant technologique dans le domaine de la microscopie confocale. Grâce au comptage de photons et à une puissance d'éclairage contrôlée et surveillée activement, les chercheurs peuvent désormais générer des données véritablement quantitatives et reproductibles entre expériences et laboratoires. La détection à haute plage dynamique élimine la saturation des images et permet la capture simultanée de structures peu visibles et très lumineuses. Et l'association du balayage galvanométrique et du balayage résonant redéfinit le délai d'obtention des résultats, permettant de capturer en temps réel des événements biologiques dynamiques.

De plus, le FV5000MPE favorise la démocratisation de l’excitation multiphotonique, rendant l’imagerie des tissus profonds accessible à davantage de laboratoires.

Au-delà de ces avancées du système, le FV5000 utilise une automatisation intelligente et un logiciel piloté par l’IA pour simplifier les flux de travail complexes et réduire les temps de configuration, rendant ainsi les systèmes confocaux et multiphotoniques plus accessibles aux nouveaux utilisateurs.

Le FLUOVIEW FV5000 est un système de microscope à balayage laser tout-en-un qui donne aux chercheurs les moyens de travailler plus vite, plus intelligemment et de façon plus créative, générant des images de qualité publication et des données quantitatives robustes.

« Le FV5000 permet à un plus grand nombre de scientifiques de repousser les limites de la découverte ; l’imagerie avancée n’est plus réservée aux laboratoires spécialisés. » — Buelent Peker

Pour les chercheurs en sciences de la vie, l'avenir n'a jamais paru aussi enthousiasmant.