La ricerca nelle scienze della vita sta entrando in un'era di trasformazione. Nei laboratori di imaging e nei core facility di ricerca, gli scienziati si trovano ad affrontare una crescente richiesta di dati quantitativi ad alta risoluzione per rispondere a domande biologiche sempre più complesse. L'imaging di precisione è tutto per i ricercatori leader nei settori delle neuroscienze, della biologia cellulare, della scoperta di farmaci, della ricerca sul cancro e della biologia dello sviluppo.

Storicamente, i ricercatori hanno spesso dovuto scendere a compromessi difficili nel loro lavoro: bilanciare la qualità delle immagini con la velocità, oppure sacrificare la profondità sperimentale per la conservazione del campione. L'osservazione di delicati processi cellulari vivi richiedeva cautela per evitare la fototossicità, mentre l'imaging in profondità nei tessuti era spesso limitato dalla dispersione ottica o da configurazioni complesse delle apparecchiature. Anche la riproducibilità di base ha rappresentato una sfida, con lievi variazioni nella calibrazione degli strumenti che portano a risultati incoerenti tra utilizzatori, esperimenti o laboratori.

Con l'introduzione del microscopio confocale e a scansione laser multiphoton FLUOVIEW™ FV5000, queste barriere possono diventare un ricordo del passato. «Il FV5000 ridefinisce i confini della risoluzione, della velocità e della versatilità sperimentale», afferma Buelent Peker, Senior Product Marketing Manager di Evident e rinomato esperto di microscopia a scansione laser. «Ciò che un tempo era incredibilmente impegnativo, ora può diventare routine grazie a nuovi entusiasmanti progressi nella tecnologia di scansione, nei rilevatori e nei software.»

Nuovi progressi nei microscopi confocali per le scienze della vita

FV5000 è basato su profonde innovazioni nella microscopia confocale per le scienze della vita. Quando vengono combinate, queste innovazioni danno origine a un'esperienza di imaging radicalmente diversa per gli utilizzatori di tutti i livelli—dove velocità, sensibilità e accuratezza quantitativa operano in sinergia, non in opposizione tra loro.

1. Analisi quantitativa con conteggio dei fotoni

Uno degli sviluppi più trasformativi nella moderna microscopia confocale è la tecnologia del conteggio dei fotoni. Tradizionalmente, i microscopi confocali si basavano sul confronto delle intensità luminose relative per dedurre le differenze tra i campioni. Sebbene questo metodo fornisca informazioni qualitative, è altamente sensibile a fattori esterni quali la tensione del rivelatore, l'allineamento, la stabilità della potenza laser e persino le variazioni di temperatura in laboratorio. Piccole variazioni tra gli esperimenti possono causare misurazioni incoerenti. Ciò rende i confronti quantitativi inaffidabili, soprattutto quando si cerca di replicare i risultati in più punti temporali, progetti o studi collaborativi.

«Quando si confrontano i livelli di intensità, ci sono sempre delle difficoltà», afferma Peker. «È necessario controllare il proprio strumento in modo molto rigoroso, e i rilevatori devono fornire un output di conteggio con una sensibilità specifica: l’amplificazione del segnale che raggiunge il rilevatore deve essere sempre la stessa, così come la potenza del laser che raggiunge il campione.» Inoltre, bisogna assicurarsi di utilizzare sempre lo stesso canale sul sistema, poiché la sensibilità può variare da un rilevatore all'altro.

Tecnologia di rilevamento SilVIR™

Il nuovo standard nella microscopia avanzata, la tecnologia di rilevamento SilVIR™ di nuova generazione dell'FV5000 offre una quantificazione a livello di fotoni che cambia radicalmente questo paradigma, rilevando e contando i singoli fotoni e creando una vera misurazione assoluta dell'intensità della fluorescenza, invece di una stima relativa. Ciò trasforma la microscopia confocale in uno strumento quantitativo assoluto, colmando il divario tra imaging qualitativo e analisi dei dati riproducibili.

Riproducibilità tra laboratori

Uno dei principali vantaggi dell’analisi quantitativa è la riproducibilità tra laboratori. Per collaborazioni su larga scala o studi di ricerca multi-sito, la riproducibilità affidabile è fondamentale: il conteggio dei fotoni elimina le variabili precedenti e consente ai ricercatori di strutture diverse di raccogliere dati direttamente confrontabili.

Per garantire ulteriormente la coerenza, il Laser Power Monitor (LPM) del FV5000 misura e calibra automaticamente la potenza del laser in tempo reale. Ciò garantisce che condizioni di imaging identiche—come la potenza di eccitazione e la risposta del rilevatore—siano mantenute tra le sessioni e i sistemi. Insieme, il conteggio dei fotoni e la standardizzazione del LPM eliminano le principali fonti di variabilità, permettendo un'effettiva comparabilità quantitativa.

Ciò è particolarmente cruciale in discipline come le neuroscienze o la ricerca farmacologica, dove la replicazione sperimentale è essenziale per validare i risultati e garantire l'integrità dei dati tra i centri di ricerca.

Coerenza all'interno degli esperimenti

Il monitoraggio dei processi di sviluppo o della progressione della malattia richiede acquisizioni costanti per settimane o anche per mesi. Il conteggio dei fotoni garantisce misurazioni costanti e affidabili, consentendo agli scienziati di confrontare con sicurezza i punti temporali senza preoccuparsi delle variazioni di calibrazione giornaliere.

Inoltre, il Laser Power Monitor (LPM) misura e compensa continuamente le fluttuazioni della potenza del laser durante l'acquisizione. In questo modo si mantengono identiche condizioni di eccitazione di giorno in giorno, anche durante esperimenti a lungo termine. Insieme, il conteggio dei fotoni e la stabilità dell'LPM garantiscono la coerenza quantitativa, consentendo ai ricercatori di monitorare con sicurezza le più piccole variazioni biologiche.

L'eliminazione delle supposizioni

In passato, gli scienziati dovevano dedicare tempo prezioso a regolare le impostazioni del rilevatore per evitare la saturazione o il rumore. Ciò introduce sia errori umani che complessità del flusso di lavoro, il che risulta particolarmente impegnativo per gli utilizzatori meno esperti. Grazie alla tecnologia SilVIR dell'FV5000, queste regolazioni manuali vengono eliminate, rendendo l'imaging più semplice e affidabile per utilizzatori di tutti i livelli di esperienza.

«La quantificazione a livello di fotone resa possibile dall’FV5000 elimina l’incertezza dall’imaging di precisione e garantisce che i risultati siano affidabili tra diversi esperimenti e laboratori.»

2. Sensibilità e Rilevamento ad Elevata Gamma Dinamica

I campioni biologici presentano spesso intensità di segnale estremamente diverse. Ad esempio, un soma neuronale può emettere una fluorescenza intensa, mentre i sottili processi assonali producono segnali deboli. Storicamente, i ricercatori dovevano regolare manualmente il guadagno o la potenza del laser per catturare entrambi, spesso richiedendo più immagini con impostazioni diverse.

Questo approccio richiede molto tempo e impedisce un confronto quantitativo diretto tra regioni o campioni. L'ampia gamma dinamica (HDR) del FV5000—la più ampia del settore—risolve questa sfida acquisendo simultaneamente sia segnali deboli che luminosi all'interno di una singola immagine. Garantisce una sensibilità eccezionale, consentendo ai ricercatori di esplorare l'intera complessità dei loro campioni.

«Idealmente, si desidera avere un rilevatore molto sensibile e un'ampia gamma dinamica, entrambe presenti nell'FV5000», spiega Peker. "Con i sistemi tradizionali, se si desidera visualizzare efficacemente intensità e strutture, è necessario regolare il voltaggio per evidenziare le zone meno luminose—ma se si aumenta il voltaggio si ottiene un diverso livello di amplificazione e la gamma dinamica si riduce." Viceversa, se hai zone molto luminose, devi ridurre i livelli. «Si finisce con tutti questi aumenti e diminuzioni per diverse parti dello stesso campione, il che non è l'ideale per la coerenza dell'acquisizione o il confronto dell'intensità.»

Eliminazione delle immagini sature

Un altro svantaggio dell'impossibilità di visualizzare simultaneamente segnali deboli e luminosi è la generazione di immagini sature. La saturazione si verifica quando le regioni luminose sovrastano il rilevatore, tagliando i dati e distruggendo l'integrità quantitativa. L'HDR dell'FV5000 elimina questo rischio, preservando le informazioni sull'intero spettro di intensità.

«Alla fine, la saturazione uccide tutto ciò che deve essere analizzato: deve essere evitata con ogni mezzo.» «L'HDR è di grande aiuto.» — Buelent Peker

3. Tecniche di imaging e scansione a banda larga

La microscopia confocale non è più limitata alle gamme di luce visibile: il FV5000 può coprire un intervallo di 400–900 nm grazie ai laser vicino infrarosso (NIR), consentendo l'utilizzo di coloranti NIR che offrono vantaggi unici per la ricerca nelle scienze della vita.

Penetrazione più in profondità nei tessuti

La luce NIR si disperde meno nei tessuti biologici, consentendo ai ricercatori di eseguire imaging più profondo di strutture 3D come organoidi, embrioni o campioni di tessuto spessi. «Con i coloranti NIR si può andare più in profondità nei tessuti 3D e nei campioni spessi: la profondità di penetrazione è semplicemente migliore, con meno dispersione grazie ai coloranti con maggiore spostamento verso il rosso», afferma Peker.

Fototossicità ridotta

Le lunghezze d'onda più lunghe dell'FV5000 sono più delicate sulle cellule vive, permettendo di prolungare la vitalità delle cellule durante esperimenti di imaging a lungo termine. Ciò è particolarmente utile per la biologia dello sviluppo e per i test sui farmaci, dove le cellule devono rimanere sane per giorni o addirittura settimane. Secondo Peker, «Con i coloranti NIR, è possibile prolungare notevolmente l’imaging delle cellule vive in un ambiente incubato: le cellule non moriranno così rapidamente grazie alla ridotta fototossicità.»

4. Doppia modalità di scansione: galvanica e risonante

Pur essendo precisa, la scansione galvanometrica tradizionale presenta limitazioni di velocità, rendendo difficile acquisire eventi biologici rapidi o eseguire scansioni efficienti di grandi volumi di tessuto. La scansione risonante affronta questa sfida, aumentando notevolmente la frequenza dei fotogrammi.

FV5000 combina entrambe le strategie di scansione, offrendo flessibilità bimodale. La modalità Galvo può essere utilizzata per esperimenti che richiedono il massimo rapporto segnale/rumore o pattern di stimolazione complessi, come l’optogenetica. La modalità risonante, ideale per l’imaging ad alta velocità di processi dinamici, può quindi essere utilizzata per applicazioni quali il traffico di vescicole, i picchi di calcio o le scansioni dell’intero cervello con una produttività superiore.

«La flessibilità di scansione del FV5000 garantisce che i ricercatori possano ottimizzare il loro imaging per qualsiasi applicazione», afferma Peker. Con entrambe le modalità di scansione galvanica e risonante disponibili nello stesso sistema, è possibile passare facilmente da una modalità all'altra secondo necessità, senza compromettere le prestazioni o la qualità dell'immagine.

5. Imaging ad alto FPS

Il FV5000 offre anche imaging ad alto numero di fotogrammi al secondo (FPS), essenziale per compiti scientifici specifici. L'imaging ad alto numero di fotogrammi al secondo (FPS) è ideale per monitorare strutture cellulari che si muovono rapidamente, come le vescicole o gli elementi del citoscheletro, e per registrare eventi fisiologici rapidi. L'imaging ad alto FPS può anche essere utilizzato per ridurre i tempi di acquisizione nelle scansioni a mosaico XYZ di grandi dimensioni, rendendo i flussi di lavoro che durano ore da sei a dieci volte più rapidi.

_{Sezione di cervello di topo chiarificata con SeeDB2. Neuroni piramidali dello strato corticale 5 esprimenti EYFP nel ceppo Thy1-YFP-H. Campione per gentile concessione di: Dottori Satoshi Fujimoto e Takeshi Imai, Graduate School of Medical Sciences, Università di Kyushu.}

6. Tecnologia dei Laser a Fibra

L'eccitazione multifotonica (MPE) è essenziale per l'imaging in profondità di tessuti spessi e a forte diffusione, tra cui sezioni di cervello, organoidi ed embrioni viventi. I sistemi MPE tradizionali spesso si basavano su ingombranti laser a infrarossi a impulsi di femtosecondi che richiedevano grandi tavoli ottici, un sistema di condizionamento dell'aria specializzato per gestire il calore e personale tecnico esperto. Questi sistemi erano proibitivamente costosi e difficili da integrare, il che significava che la MPE era solitamente limitata a strutture con budget consistenti e personale numeroso.

Grazie all'integrazione di innovazioni nella tecnologia laser a fibra, il FLUOVIEW™ FV5000MPE sta rivoluzionando il panorama multifotonico, offrendo a più laboratori l'opportunità di studiare campioni tridimensionali spessi e organismi viventi.

Compatto e Accessibile

I laser a fibra multifotone del FV5000MPE risultano molto più compatti e facili da integrare nei sistemi esistenti rispetto ai tradizionali laser IR a femtosecondi. Sono anche molto meno sensibili ai cambiamenti ambientali, come le vibrazioni o le fluttuazioni di temperatura.

Lunghezze d'Onda Fisse

I laser a fibra dell'FV5000MPE possono operare a lunghezze d'onda singole e fisse—circa 920-950 nm per l'eccitazione GFP—garantendo un funzionamento semplice e a costi contenuti, coprendo al contempo la maggior parte delle esigenze di ricerca più comuni. «I laser multifotonici accoppiati in fibra a lunghezza d'onda fissa sono facili da controllare e utilizzare», afferma Peker. Quindi si può decidere di utilizzare, ad esempio, 925 nanometri per un laser MPE fisso, che copre il segnale più comunemente utilizzato per GFP negli studi su animali vivi.

Democratizzazione dell’imaging profondo

Una soluzione economica e facilmente implementabile per l’imaging multifotonico di routine, FV5000MPE rende il multifotone più accessibile ai piccoli laboratori e alle core facility, ampliando la sua diffusione oltre i centri di ricerca d’eccellenza. I laser a fibra dell'FV5000MPE non solo semplificano l'imaging multifotonico, ma ne migliorano anche l'affidabilità, facilitando l'imaging di organismi viventi per periodi prolungati senza le complicazioni dei sistemi tradizionali.

«Con il FV5000MPE, la tecnologia multifotone è più accessibile, più economica e più facile da integrare nei laboratori», afferma Peker. "I recenti sviluppi ci hanno permesso di creare sistemi MPE compatti, semplici da usare e da aggiornare."

«I laser accoppiati in fibra stanno aprendo le porte all'imaging dei tessuti profondi per i laboratori che prima non avevano le risorse necessarie.» «Un passo importante verso la democratizzazione della tecnologia MPE.» — Buelent Peker

^{Cellule HeLa coltivate che esprimono Lifeact-mScarlet-I ed EB3-3xmNeonGreen. Campione per gentile concessione di: Haruka Mii, Prof. Kazuhiro Aoki, Scuola di Specializzazione in Biostudi, Università di Kyoto. Per saperne di più sull'origine delle cellule HeLa, visita henriettalacksfoundation.org.}

Una Svolta Tecnologica

Il nuovo FV5000 rappresenta una svolta tecnologica nella microscopia confocale. Grazie al conteggio dei fotoni e alla potenza di illuminazione controllata e monitorata attivamente, i ricercatori possono ora generare dati veramente quantitativi, riproducibili tra esperimenti e laboratori. Il rilevamento ad ampia gamma dinamica elimina la saturazione dell’immagine e consente la cattura simultanea di strutture deboli e brillanti. E la combinazione di scansione galvanica e risonante sta ridefinendo il tempo necessario per ottenere risultati, permettendo di catturare eventi biologici dinamici in tempo reale.

Inoltre, il FV5000MPE contribuisce a democratizzare l'eccitazione multifotonica, rendendo l'imaging dei tessuti profondi accessibile a una più ampia gamma di laboratori.

Oltre a questi progressi del sistema, il FV5000 utilizza automazione intelligente e software basato sull'intelligenza artificiale per semplificare i flussi di lavoro complessi e ridurre i tempi di configurazione, rendendo i sistemi confocali e multifotoni più accessibili ai nuovi utilizzatori.

Il FLUOVIEW FV5000 è un sistema di microscopio a scansione laser all-in-one che consente ai ricercatori di lavorare in modo più rapido, intelligente e creativo, generando immagini pronte per la pubblicazione e dati quantitativi solidi.

«Il FV5000 permette a un numero sempre maggiore di scienziati di ampliare i confini della scoperta: l’imaging avanzato non è più limitato ai laboratori specializzati.» — Buelent Peker

Per i ricercatori delle scienze della vita, il futuro non è mai stato così entusiasmante.