Correzione automatica dell'aberrazione sferica per l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione e a elevato contrasto

Introduzione

I microscopi a fluorescenza trovano ampio impiego nell'ambito delle scienze della vita e della ricerca medica per osservazioni morfologiche e analisi quantitative di cellule e altri campioni biologici. Le lenti degli obiettivi per i microscopi biologici sono generalmente progettate ipotizzando che un coprivetrino standard dallo spessore di 0,17 mm sia a stretto contatto con il campione.

Tuttavia, utilizzando lenti per obiettivi ad alta apertura numerica (Numerical Aperture, NA), lievi differenze, quali variazioni dello spessore del coprivetrino o un posizionamento del campione a maggiore profondità, possono essere causa di aberrazioni sferiche, con conseguente deterioramento della qualità dell'immagine. In molti casi, queste lenti per obiettivi ad alta apertura numerica sono dotate di un elemento, denominato anello di correzione, che viene utilizzato per modificare l'aberrazione sferica in base allo spessore del coprivetrino. Una regolazione precisa dell'anello di correzione dell'obiettivo è essenziale per ottenere una chiarezza ottimale dell'immagine.

La piattaforma per microscopio invertito IXplore™ IX85 di Evident automatizza il processo per mezzo di un software intuitivo e di un anello di correzione motorizzato. Facendo clic su un pulsante nel software cellSens™, la piattaforma aziona un meccanismo di controllo per regolare automaticamente l'anello di correzione in base a un'ampia gamma di obiettivi ad alta apertura numerica. Questo sistema automatico di correzione dell'obiettivo consente l'acquisizione efficiente di immagini chiare, con un'aberrazione sferica ridotta e valori elevati di risoluzione e contrasto.

Le sfide della correzione dell'aberrazione sferica

Quando lo spessore del coprivetrino differisce rispetto al valore standard di 0,17 mm, i raggi di luce centrali e periferici che attraversano l'obiettivo non convergono sullo stesso punto focale e ciò comporta una riduzione di risoluzione e contrasto. Questo fenomeno è noto con il termine di aberrazione sferica e può essere risolto ruotando l'anello di correzione, in modo da allineare la posizione focale dei raggi di luce (Figura 2).

La procedura non è scevra da difficoltà: in primo luogo è necessario regolare con precisione contemporaneamente l'anello di correzione e la messa fuoco, in modo da individuare la posizione in cui l'immagine è più chiara. Inoltre, la determinazione del punto di correzione migliore spesso richiede il confronto di diverse immagini per individuare lievi miglioramenti della chiarezza; a tal fine è necessario ruotare l'anello, regolare la messa a fuoco, valutare la chiarezza dell'immagine per poi ripetere la procedura fino a identificare la posizione di correzione ideale dell'anello. Gli utilizzatori del microscopio necessitano di competenza per effettuare queste regolazioni precise e ciò limita la capacità di ottenere un'elevata riproducibilità tra i diversi esperimenti.

Le regolazioni manuali richiedono inoltre molto tempo, e questo è un problema nel caso dell'imaging a fluorescenza, in cui il campione può venire degradato dal fenomeno del photobleaching. I livelli dei segnali possono già essere bassi nell'imaging a fluorescenza, per cui un elevato contrasto grazie alla correzione rapida e precisa dell'aberrazione sferica è essenziale per un'accurata visualizzazione ed analisi.

Presentazione di un metodo automatico di correzione dell'aberrazione sferica

La chiarezza dell'immagine può essere espressa come intensità del contrasto dell'immagine. Con la variazione dell'angolazione dell'anello di correzione e della posizione della messa a fuoco, il contrasto dell'immagine derivante prende una forma inclinata, che ricorda quella di una montagna, come illustrato nella Figura 3a. La punta di questa forma (Figura 3b) rappresenta lo stato più corretto dell'aberrazione sferica e la regolazione dell'anello di correzione mira a individuarne la posizione. Se la correzione è insufficiente e non corrisponde alla punta (Figura 3c), l'immagine sarà sfocata anche nel caso in cui la messa a fuoco sia corretta.

Per creare una mappa di calore di questo tipo, generalmente è necessario acquisire diverse immagini mentre si modificano l'anello di correzione e la messa a fuoco. Questa procedura richiede molto tempo e causa lo sbiadimento del campione durante l'osservazione della fluorescenza, con conseguenze in termini di valore di contrasto e riduzione della precisione. Per questo motivo, la correzione automatica dell'aberrazione sferica deve essere rapida e accurata, in modo da ridurre per quanto possibile lo sbiadimento.

La correzione automatica dell'aberrazione sferica per l'osservazione della fluorescenza di recente introduzione nella piattaforma IXplore IX85 con il software cellSens adotta il metodo Nelder-Mead, che consente una regolazione efficiente della posizione della messa a fuoco e dell'angolazione dell'anello di regolazione.

La mappa di calore del contrasto varia in termini di gradiente e ampiezza, a seconda della lente dell'obiettivo. Tuttavia, il metodo Nelder-Mead è robusto rispetto alla forma della funzione di ottimizzazione target e può essere applicato anche se non è lineare, il che lo rende adatto alla regolazione della mappa di calore definita per ciascuna lente dell'obiettivo.

La ricerca del contrasto viene effettuata mediante l'aggiornamento di tre punti, o simplex. In primo luogo si ottiene il contrasto nei tre punti iniziali, come mostrato in Figura 4 (1), dopodiché viene aggiornata la posizione del punto con il contrasto più basso (2). Viene quindi ripetuta la procedura di aggiornamento di uno o due punti, riducendo l'intervallo simplex e interrompendo la ricerca quando il risultato è inferiore al criterio di convergenza, come mostrato da (3) a (10). Riducendo l'intervallo di ricerca in modo adattivo anziché esplorare l'intera area simultaneamente, questo metodo rende possibile determinare la posizione con il contrasto più elevato in modo efficiente senza effettuare passaggi di imaging superflui.

Il metodo Nelder-Mead offre il vantaggio di poter modificare rapidamente la ricerca, rispetto a un'analisi esaustiva per determinare il massimo contrasto. In condizioni di prova con una lente per obiettivo UPLXAPO40X e un'esposizione della fotocamera di 200 millisecondi, il metodo Nelder-Mead richiede circa 20 secondi, rispetto ai 45 secondi necessari per derivare la posizione con il contrasto più elevato con il metodo esaustivo convenzionale, il quale richiede un periodo di tempo più lungo in quanto divide l'angolo dell'anello di correzione θ in 10 parti e Z in 10 parti, coprendo complessivamente 100 punti. Il confronto dimostra che il metodo automatico riduce il tempo di regolazione di oltre il 50 per cento.

Sintesi

L'anello di correzione motorizzato e l'algoritmo di regolazione automatico della piattaforma IXplore IX85 consentono una correzione dell'aberrazione sferica, la quale è spesso difficile da ottenere manualmente; inoltre riduce il photobleaching nella microscopia a fluorescenza grazie a regolazioni rapide e precise. L'anello si integra con facilità con il sistema IX85, controllato in modo semplice con il software cellSens, ed è compatibile con numerosi obiettivi standard della gamma Evident. Grazie a questa innovazione, gli utilizzatori con diversi livelli di competenza sono in grado di acquisire immagini a fluorescenza chiare con elevata risoluzione e contrasto.