Correzione automatica dell'aberrazione sferica con TruResolution™ per l'imaging profondo ad alta risoluzione di tessuti

Negli ultimi anni, le tecnologie di microscopia per le scienze della vita si sono evolute rapidamente, con una crescente domanda di imaging ad alta risoluzione di strutture dei tessuti profondi. Tuttavia, l'imaging profondo è spesso influenzato da aberrazioni ottiche, in particolare dall'aberrazione sferica, che può causare un notevole peggioramento della qualità dell'immagine. Correggere con precisione queste aberrazioni è pertanto essenziale.

Questo white paper offre una panoramica dettagliata delle innovazioni tecnologiche e dei vantaggi introdotti dal sistema di correzione automatizzata dell'aberrazione sferica TruResolution™ nei microscopi confocali FLUOVIEW™ FV5000 e nei microscopi a scansione laser multifotone FV5000MPE. La discussione evidenzia il modo in cui il sistema TruResolution affronta le sfide tradizionali della correzione dell'aberrazione sferica attraverso l'automazione e un'ottimizzazione intelligente.

Panoramica della correzione manuale dell'aberrazione sferica e delle sfide associate

Gli obiettivi sono composti da più elementi ottici e fabbricati tramite processi di progettazione e ingegneria ad alta precisione per consentire un'osservazione estremamente accurata di strutture microscopiche come cellule e organelli. Questi obiettivi sono progettati per eliminare le aberrazioni (errori nella formazione dell'immagine), consentendo immagini dei campioni estremamente nitide in condizioni ideali.

Tuttavia, quando l'indice di rifrazione del mezzo, come il campione o il coprioggetto, differisce da quello del liquido d'immersione, la rifrazione della luce provoca una discrepanza nella profondità focale tra i raggi che entrano dal centro e quelli che entrano dalla periferia dell'obiettivo. Questo fenomeno, noto come aberrazione sferica, provoca una riduzione della risoluzione e dell'intensità della fluorescenza.

Un metodo efficace per correggere questa aberrazione consiste nel regolare il collare di correzione integrato nell'obiettivo. Ruotando il collare di correzione, è possibile compensare la differenza di profondità focale tra i raggi centrali e periferici, ottenendo così prestazioni di imaging ottimali.

Ad esempio, quando si mette a fuoco in acqua utilizzando un obiettivo per immersione in acqua (Figura 1a), impostando il collare di correzione su 0 si ottiene un imaging ottimale. Invece, durante l'osservazione del tessuto attraverso un coprioggetto (Figura 1b), si genera aberrazione sferica se il collare di correzione non viene regolato, provocando la dispersione del punto focale e riducendo la risoluzione e l'intensità della fluorescenza. Una corretta regolazione del collare di correzione (Figura 1c) può ovviare efficacemente a questa aberrazione.

Tuttavia, nella microscopia a scansione laser, le osservazioni avvengono solitamente in un ambiente di camera oscura, il che complica la regolazione manuale del collare di correzione durante l'acquisizione delle immagini. Inoltre, la regolazione del collare di correzione altera la posizione focale e occorrono esperienza e competenza per ottenere impostazioni ottimali.

Inoltre, nell'imaging di tessuti profondi, anche se il collare di correzione viene regolato in prossimità della superficie, l'aberrazione sferica riappare con l'aumentare della profondità di imaging (Figura 1d). Pertanto, è estremamente difficile impostare il valore di correzione ottimale per ogni profondità durante l'acquisizione di immagini Z-stack.

Figure 1: Schematic figures of spherical aberration caused by cover glass or tissue and the effect of correction collar adjustment.

^{Figura 1. Diagrammi schematici dell'aberrazione sferica causata dal coprioggetto o dal tessuto e dell'effetto della regolazione del collare di correzione.}

^{a) Messa a fuoco in condizioni ideali. Quando si osserva un campione immerso in acqua utilizzando un obiettivo per immersione in acqua, i raggi luminosi provenienti sia dal centro che dalla periferia della lente convergono alla stessa profondità, senza alcuna aberrazione sferica.}

^{b) Messa a fuoco con aberrazione sferica. Quando si osserva un tessuto attraverso un coprioggetto con l'acqua come mezzo di immersione, la rifrazione a livello dell'interfaccia del vetrino causa una discrepanza nella profondità focale tra i raggi centrali e quelli periferici, causando un'aberrazione sferica.}

^{c) Messa a fuoco dopo la correzione dell'aberrazione sferica. Regolando correttamente il collare di correzione, la differenza di profondità focale tra i raggi centrali e quelli periferici viene compensata, consentendo così di ottenere condizioni di messa a fuoco ideali.}

^{d) Messa a fuoco più in profondità dopo la correzione a livello della superficie. Quando il collare di correzione è impostato per l'osservazione a livello della superficie e il piano focale viene spostato in profondità, l'aberrazione sferica si ripresenta causando la diffusione del punto focale.}

Ottimizzazione della correzione dell'aberrazione sferica mediante un collare motorizzato e algoritmi automatizzati

Il sistema TruResolution affronta le sfide convenzionali della correzione dell'aberrazione sferica consentendo una regolazione intuitiva e precisa del collare di correzione.

Innanzitutto, dotando l'obiettivo di un collare di correzione motorizzato si consente agli utenti di controllare il collare tramite software senza toccare fisicamente l'obiettivo, anche in ambienti di camera oscura, con un netto miglioramento dell'operatività. Inoltre, il sistema include un meccanismo che regola automaticamente la posizione Z dell'obiettivo in risposta all'angolo di rotazione del collare. Ciò garantisce che la posizione focale rimanga stabile durante la regolazione del collare, mantenendo sempre una messa a fuoco precisa (Figura 2a).

Inoltre, il sistema TruResolution integra un algoritmo intelligente che determina automaticamente la posizione ottimale del collare di correzione. Acquisendo più immagini con diverse impostazioni del collare e analizzandone le curve di contrasto, il sistema identifica il punto di contrasto massimo per calcolare con elevata precisione il valore di correzione ideale (Figura 2b). Ciò consente agli utenti di applicare la correzione ottimale con un solo clic dall'interfaccia software.

Durante l'acquisizione di immagini Z-stack, gli utenti possono pre-registrare le posizioni appropriate del collare di correzione per ogni profondità. Il collare di correzione ruota quindi automaticamente durante l'acquisizione delle immagini, garantendo una qualità ottimale dell'immagine su ogni piano focale. Con il sistema TruResolution, ora è possibile eseguire l'imaging Z-stack dei tessuti profondi con una correzione precisa dell'aberrazione sferica, ottenendo immagini sempre luminose e ad alta risoluzione a tutte le profondità.

Figure 2: Change of focal plane by rotating correction collar. In case of conventional objective lens, focal plane changes by rotating the correction collar.

Figure 2: Finding optimum correction collar angle θopt.

^{Figura 2.} ^{Figure che rappresentano in modo schematico il controllo esercitato tramite il collare di correzione e l'algoritmo di ottimizzazione nel sistema TruResolution.}

^{a) Quando i collari degli obiettivi convenzionali vengono ruotati, cambia anche il piano focale (sinistra). Gli obiettivi TruResolution mantengono il piano focale modificando automaticamente la posizione Z dell'obiettivo in base all'angolo di rotazione (a destra).}
^{b) Individuazione dell'angolo di correzione ottimale del collare (θopt): la curva di contrasto viene determinata calcolando il valore di contrasto di ogni immagine acquisita con diverse angolazioni del collare di correzione. La posizione ottimale del collare di correzione viene calcolata determinando il picco di questa curva di contrasto.}

Imaging di tessuti profondi tramite microscopia multifotone con il sistema TruResolution

Il sistema TruResolution ha reso possibili regolazioni precise del collare di correzione durante l'imaging Z-stack profondo, un'operazione che risultava difficile in passato. Di conseguenza, ora è possibile acquisire immagini luminose e ad alta risoluzione sempre, a tutte le profondità.

Ciò è particolarmente importante nella microscopia a eccitazione multifotone, dove la risoluzione dipende fortemente dalle dimensioni del punto di eccitazione a causa dell'assenza di fori confocali o telecamere. Nell'imaging dei tessuti profondi, i segnali in fluorescenza tendono ad attenuarsi a causa della dispersione della luce. Tuttavia, mantenere dimensioni ridotte del punto di eccitazione aumenta la densità di eccitazione, permettendo di compensare la perdita di segnale. Pertanto, la correzione dell'aberrazione sferica è di fondamentale importanza sia per la risoluzione che per l'intensità della fluorescenza.

La Figura 3 mostra i risultati delle microsfere a fluorescenza per imaging immerse in un gel che simula l'indice di rifrazione e le proprietà di scattering del tessuto cerebrale di topo. Grazie al sistema TruResolution, la dimensione del punto di eccitazione rimane costante a diverse profondità e la luminosità dell'immagine è stabile. Invece, quando il collare di correzione dipende in modo fisso dall'impostazione della superficie, la dimensione del punto aumenta con la profondità, con conseguente riduzione della luminosità.

Figure 3: Fluorescent micro bead(φ200nm) in gel simulating optical characteristic of live mouse brain.

^{Figura 3.} ^{Effetto del sistema TruResolution sull'imaging profondo di microsfere fluorescenti in un gel che simula le proprietà ottiche del cervello di topo. Microsfere a fluorescenza (diametro = 200 nm) in un gel con caratteristiche ottiche simili a quelle del cervello di topo vivo (indice di rifrazione 1,36, coefficiente di diffusione della luce 43 cm-1) eccitate a 960 nm con potenza laser costante utilizzata per tutte le immagini.}

^{Riga superiore: immagini XZ di microsfere acquisite a varie profondità utilizzando il sistema TruResolution per la compensazione automatica dell'aberrazione sferica.}
^{Riga inferiore: immagini XZ di microsfere acquisite a diverse profondità utilizzando un collare di correzione fisso regolato inizialmente per un imaging ottimale sulla superficie del gel.}
^{I livelli di luminosità delle immagini sono normalizzati a ogni profondità. Tutte le immagini sono state acquisite con l'obiettivo FV30-AC25W.}

La Figura 4 successiva mostra l'imaging in vivo dei dendriti neuronali in un cervello del topo a una profondità di 400 µm. Utilizzando il sistema TruResolution si ottengono immagini più luminose e nitide anche in condizioni di eccitazione identiche.

Figure 4: In vivo observation of neuronal dendrite in a live mouse brain (Thy1-YFP-H mouse, sensory cortex) acquired at 400 µm depth, with excitation at 960 nm.

^{Figura 4}^{. Imaging in vivo dei dendriti neuronali in un cervello di topo vivo (topo Thy1-YFP-H, corteccia sensoriale).}
^{Le immagini sono state acquisite a una profondità di 400 µm con lunghezza d'onda di eccitazione di 960 nm e obiettivo FV30-AC25W, con la stessa intensità di eccitazione.}

^{Immagine in alto: la compensazione automatica dell'aberrazione sferica tramite l'obiettivo TruResolution FV30-AC25W produce immagini nitide e ad alto contrasto delle spine dendritiche.}
^{Immagine in basso: per consentire un confronto, lo stesso campo visivo è stato acquisito con il collare di correzione ottimizzato per la superficie del campione, come avviene solitamente con i collari di correzione convenzionali.}

Il sistema TruResolution è efficace anche con campioni di tessuto resi nitidi. Nei campioni di tessuto resi nitidi, l'indice di rifrazione può variare in modo significativo a seconda dei reagenti utilizzati, influenzando potenzialmente le prestazioni ottiche. Ad esempio, l'obiettivo XLPLN10XSVMP supporta un intervallo di indice di rifrazione compreso tra 1,33 e 1,52. Tuttavia, se il collare di correzione non viene regolato correttamente, possono verificarsi aberrazioni che causano un peggioramento della qualità dell'immagine.

Con il sistema TruResolution, il collare di correzione si regola automaticamente anche con campioni resi nitidi, assicurando immagini sempre luminose e ad alta risoluzione.

La Figura 5a mostra un'immagine XZ di uno Z-stack acquisito da un cervello di topo reso nitido con Sca l eA2, osservato fino a una profondità di circa 4 mm. Utilizzando il sistema TruResolution, sono state ottenute immagini luminose e uniformi anche in regioni profonde. In particolare, quando l'indice di rifrazione del mezzo di immersione corrisponde a quello del campione, è necessaria una sola regolazione del collare di correzione.

La Figura 5b presenta un'immagine XY a una profondità di 2,7 mm: qui l'immagine acquisita con il sistema TruResolution risulta nettamente più luminosa e chiara rispetto a quella ottenuta con un'impostazione fissa del collare di correzione.

Figure 5: Mouse brain (Thy1-YFP-H mouse）cleared with ScaleA2.

^{Figura 5.} ^{Sistema TruResolution per campioni di cervello di topo resi nitidi.}

^{I campioni di cervello di topo sono stati resi nitidi utilizzando Sca}^l^{eA2. L'immagine di sinistra è stata acquisita con regolazione automatica del collare di correzione tramite il sistema TruResolution, mentre l'immagine di destra è stata acquisita con regolazione manuale del collare di correzione in base all'indice di rifrazione del reagente di chiarificazione CUBIC. L'intensità dell'eccitazione era la stessa in entrambe le condizioni. Lunghezza d'onda di eccitazione: 960 nm; obiettivo: FV30-AC10SV.}
^{a) Proiezione di massima intensità di una sezione di 250 µm di spessore sull'asse Y dopo l'acquisizione Z-stack.}

^{b) Proiezione di intensità massima di una sezione di 100 µm di spessore a una profondità di 2,7 mm sull'asse Z.}

Imaging ad alta risoluzione nella microscopia confocale a scansione laser utilizzando il sistema TruResolution

Nella microscopia confocale a scansione laser, variazioni del coprioggetto possono causare aberrazione sferica, rendendo difficile acquisire immagini ad alta risoluzione. Se il collare di correzione non è regolato correttamente, le immagini possono apparire sfocate e poco luminose, con una notevole riduzione dell'accuratezza dell'osservazione.

La piattaforma di microscopia invertita IXplore™ IX85 integra un'unità di azionamento del collare di correzione motorizzata compatibile con la maggior parte degli obiettivi Evident dotati di collare di correzione e progettati per microscopi invertiti. Sostituendo gli obiettivi in base alle esigenze dell'osservazione, il sistema può essere utilizzato in modo flessibile nel sistema TruResolution.

La Figura 6 mostra immagini XYZ acquisite tramite imaging Z-stack di una sezione di cervello di topo trattata con RapiClear. Quando si utilizza il sistema TruResolution, la risoluzione sugli assi XY e Z risulta migliore, con immagini più luminose e nitide.

^{Figura 6.} ^{Imaging confocale di una sezione di cervello di topo resa nitida con RapiClear 2.}

^{È stato acquisito uno Z-stack di 27 immagini a intervalli di 0,85 µm utilizzando l'obiettivo LUPLAPO25XO (NA 1,0, WD 1 mm). Le immagini visualizzate includono proiezioni di massima intensità (MIP) del piano XY e sezioni trasversali sui piani XZ e YZ. Magenta: Nuclei colorati con DAPI. Verde: neuroni etichettati con GFP.}

^{a) Immagine acquisita con regolazione automatica del collare di correzione mediante il sistema TruResolution.}
^{b) L'immagine è stata catturata con il collare di correzione ruotato completamente nella direzione dell'indice di rifrazione più basso. Questa condizione corrisponde allo scenario in cui il collare di correzione viene tenuto e ruotato mentre si applica l'obiettivo sul revolver.}
^{Questi risultati confermano che la regolazione automatica del collare di correzione con il sistema TruResolution consente l'acquisizione di immagini più luminose e ad alta risoluzione.}

Conclusioni

In questo white paper sono stati discussi la tecnologia di correzione automatica dell'aberrazione sferica del sistema TruResolution e la sua comprovata efficacia. Tradizionalmente, la regolazione del collare di correzione durante l'imaging di tessuti profondi o quando si analizzano campioni resi nitidi ha sempre presentato notevoli sfide che spesso determinano una qualità dell'immagine incostante e un funzionamento complesso.

Il sistema TruResolution affronta radicalmente questi problemi grazie a un pacchetto di funzionalità integrate: controllo motorizzato del collare di correzione, mantenimento automatico della posizione focale, valutazione intelligente delle impostazioni ottimali di correzione e piena compatibilità con l'imaging Z-stack.

Man mano che cresce la domanda di un imaging più profondo e l'esigenza di adeguarsi a diverse condizioni dei campioni, il sistema TruResolution è destinato a essere una tecnologia fondamentale in grado di supportare un imaging dalla precisione e dalla riproducibilità elevate, ampliando notevolmente le possibilità di osservazione microscopica.

Autore

Hiromi Utsunomiya
Imaging di fascia alta per le scienze della vita, Gestione del prodotto, Evident

Ringraziamenti

Immagini applicative acquisite presso il RIKEN CBS-EVIDENT Open Collaboration Center, per gentile concessione del Dott. Hiromu Monai, del Dott. Hajime Hirase e del Dott. Atsushi Miyawaki.

Bibliografia

Per maggiori dettagli sugli studi menzionati in questo white paper, leggere il seguente articolo:

1. Ue, Y., Monai, H., Higuchi, K., et al. “A Spherical Aberration-Free Microscopy System for Live Brain Imaging.” Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, Vol. 500, 236–241.

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