使用 Olympus FLUOVIEW FV3000 和 TruFocus Z 轴偏移补偿系统扩展细胞运动和增殖的延时成像

细胞培养物的成像分析是研究各种生物现象的基础。研究者可利用这项技术观察细胞增殖和随时间推移的动态。由于细胞群可以表现出局部多元化的蛋白质表达谱和运动模式，因此需要精心设计成像分析，才能避免因采样不足而产生的偏差和偏斜结果。因此，细胞培养物的成像试验应设计为能够在微孔板或培养设备上包括多个视野。本应用说明探究了 FV3000 显微镜如何利用复杂的采集参数协助多区域延时图像的采集，从而可在一次试验中获得完整、可靠的数据集。

在一次试验中拍摄多个视野

本实验使用 FV3000 共焦显微镜的多区域延时 (MATL) 模块，在约 12.5 小时内连续监测表达胞质绿色荧光蛋白 (GFP) 的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 群的运动和增殖。设计试验时，用不同的放大倍数和 Z-stack 图像参数监测多个区域尤为关键。这样才能追踪单个细胞以及整个细胞群的动态。MATL 模块允许为每个位置或平铺区域登记独立的 XYZT 参数，因此可轻松地随时间推移而为多个区域的不同放大倍数和 Z-stack 参数编程不同的成像条件。

_{图 1.多区域延时试验示意图。在多孔板中的每个孔中，编程了单个和平铺区域的多个位置以及不同的独立放大倍数和 Z-stack 参数。随后，在 12 小时 25 分钟周期中对这些登记的位置进行成像。}

利用特定位置的自动对焦功能追踪 HUVEC 细胞运动和增殖

随着时间推移而对多个区域进行成像时，最大的难点在于显微镜室内环境温度的微小波动会导致焦点呈现逐渐漂移的趋势。此外，盖玻片表面和样品组织间的距离在整个表面上可能并不相同，因而难以在多个视野中获得清晰的图像。TruFocus Z 轴漂移补偿系统，通过利用无光毒性近红外激光器定位盖玻片与样品的界面，同时确定相应的焦点位置，从而可以解决这些问题。组合使用 TruFocus 系统与 MATL 功能后，即可利用特定位置的自动对焦功能轻松登记多个独立的 XYZT 位置。

本试验随时间推移而循环聚焦具有不同放大倍数和 Z-stack 参数的多个区域，从而可在单个细胞和细胞群水平上追踪 HUVEC 运动和增殖的变化。如图 2 中的视频集锦所示，组合使用 MATL 与 TruFocus 系统后，可对多个孔重复成像，同时在 12 小时的整个试验过程中保持了清晰的焦点。

_{图 2.表达胞质 GFP 的 HUVE 的 XYZT 多区域延时成像。图中所示为具有不同采集参数的不同位置的 4 个示例图像。在 13 小时的试验过程中，TruFocus 系统用于保持不同视野中样品的对焦。}

成像条件

顶部两个窗格：
物镜 UPLXAPO20X
显微镜：FLUOVIEW FV3000RS 激光扫描共焦显微镜
激光器：488nm（GFP，绿色）
扫描仪：共振
Z 系列：16 阶
扫描区域总数：14

底部两个窗格：
物镜 UPLXAPO10X
显微镜：FLUOVIEW FV3000RS 激光扫描共焦显微镜
激光器：488nm（GFP，绿色）
扫描仪：共振
Z 系列：15 阶
扫描区域总数：48

合计试验时间：13 小时 11 分钟。

FV3000 共焦显微镜对我们的试验有何帮助

在多区域延时成像中使用 Olympus 的 TruFocus Z 漂移补偿系统保持对焦

TruFocus Z 轴漂移补偿 (ZDC) 系统是一个完全电动化的模块，可在长期延时试验中补偿焦点漂移，从而保持样品的清晰对焦。TruFocus 系统支持多种物镜以及包括玻璃和塑料底培养皿在内的容器类型，从而增强了应用的能力。因此，用户能够在多种成像条件下获得清晰、对焦和连续的延时数据，而不必担心 Z 轴漂移。

致谢

本应用说明的编写得到了以下研究者的帮助：

Advanced Solutions Life Sciences 公司首席科学家 James Hoying 博士