Observación 3D de hígado de ratón clarificado usando el microscopio FLUOVIEW FV3000

El objetivo del experimento era medir cuantitativamente la longitud y el grosor de los ramales de la estructura del árbol biliar en hígados de ratón dañados. Para el análisis inicial de las muestras, se usó un objetivo seco 20x en el FV3000 para obtener imágenes tomográficas consecutivas de campo de visión amplio del tejido biliar (marcador verde de célula epitelial biliar CK19) en muestras de tejido de hígado clarificadas de 200 µm de grosor. Esta configuración permitió llevar una observación cuantitativa efectiva de muchas muestras, y gracias a ella se pudieron encontrar muestras para examinarlas a una resolución más alta. En la imagen anterior, la barra de escala representa 100 µm.

Ratón de control

Ratón Klf5-LKO

https://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/appnote-movie_3d-biliary-tree-structure_view_480.mp4

Video: Estructura del árbol biliar del ratón de control

Con el fin de obtener imágenes tridimensionales de resolución superior, se usó el microscopio FV3000 y un objetivo de inmersión en aceite de silicona 30x de Olympus para obtener imágenes tomográficas consecutivas (intervalo axial en Z de 1 µm) de tejido biliar (marcador celular epitelial biliar CK19, verde) en tejido hepático de 200 µm de grosor clarificado con SeeDB. Esta combinación permitió desarrollar una observación en alta resolución de los árboles biliares del ratón de control y el ratón Klf5-LKO manteniendo un campo de visión amplio. En el ratón Klf5-LKO, los investigadores observaron agrupaciones de células CK19+ (flecha blanca), separadas espacialmente, del árbol biliar.

Dr. Hajime Okada

En este experimento, se analizaron las estructuras 3D de los árboles biliares relacionadas con el remodelado hepático después de una lesión en el hígado inducida por la dieta. La estructura biliar en tejidos de hígado clarificados en el ratón Klf5-LKO y el ratón de control se compararon usando un microscopio FV3000. El detector altamente sensible del microscopio permitió adquirir imágenes de campo de visión amplio con altos niveles de resolución y brillo, y con la misma rapidez que las observaciones con menos imágenes y promedio. Todo ello, nos permitió conseguir imágenes que podían usarse para efectuar análisis cuantitativos. Además, el objetivo de inmersión en aceite de silicona de Olympus permitió procesar imágenes en profundidad con alta resolución, lo que nos permitió encontrar agrupamientos de células CK19+, separadas espacialmente, del árbol biliar. Estos resultados sugieren que la estructura biliar en el remodelado de tejido bajo diversas condiciones de lesiones hepáticas puede regularse usando algunos mecanismos moleculares.

Dr. Tohru Itoh
Profesor asociado del proyecto

Hasta el momento, la investigación médica y los estudios bioquímicos centrados en el hígado confiaban en los métodos de observación 2D convencionales usando secciones de tejido en lugar de órganos enteros intactos. No obstante, con estos métodos resulta complicado detectar y entender los «colores reales» del hígado bajo condiciones fisiológicas y las diversas condiciones de las enfermedades hepáticas.

Nuestro grupo de investigación desarrolló una nueva tecnología de visualización para marcar y clarificar tejidos del hígado, que nos permitió llevar por primera vez la observación 3D de la estructura biliar en hígados intactos de ratón. Esta combinación de tecnología de tinción y clarificación nos permitió detectar los cambios estructurales biliares dinámicos (remodelado biliar) y estudiar sobre sus mecanismos reguladores y sus funciones fisiológicas. En los experimentos mencionados anteriormente, pudimos establecer un sistema experimental para visualizar la estructura biliar en 3D de forma efectiva usando el reactivo de clarificación SeeDB y un microscopio confocal. La utilización de un microscopio FV3000 permitió clarificar algunos de los mecanismos moleculares para el remodelado biliar.

Con las técnicas descritas en este documento, el microscopio confocal resulta útil para desarrollar análisis en 3D relativos a los cambios dinámicos de los diversos tejidos y las células en el hígado, como la estructura biliar. Esperamos que nuestra nueva tecnología de visualización pueda contribuir al desarrollo de dispositivos de diagnóstico y terapias para las afecciones hepáticas y la medicina regenerativa. Esto se conseguirá gracias a la comprensión del proceso de desarrollo y regeneración desde el punto de vista del remodelado de tejido y las interacciones entre las células.

2) Referencias:
H. Okada, M. Yamada, K. Kamimoto, CY. Kok, K. Kaneko, M. Ema, A. Miyajima, and T. Itoh, «The transcription factor Klf5 is essential for intrahepatic biliary epithelial tissue remodeling after cholestatic liver injury». J Biol Chem., 2018 Apr. 27;293(17):6214-6229, doi: 10.1074/jbc. RA118.002372, Epub 2018 Mar. 9.

K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima, and T. Itoh, «Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling». Elife, 2016 Jul. 19;5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034.

K. Kaneko, K. Kamimoto, A. Miyajima, and T. Itoh, «Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis» Hepatology, 2015 Jun.;61(6):2056-66, doi: 10.1002/hep.27685, Epub 2015 Apr. 22.

Sistema completamente espectral que proporciona una alta sensibilidad

La serie FV3000 emplea la tecnología TruSpectral de Olympus que difracta la luz por medio de la transmisión a través de la unidad de holograma de fase de volumen. Esta tecnología proporciona una emisión de luz mucho mayor que la de las unidades de detección espectral convencionales con rejillas de tipo reflexión, y minimiza la potencia láser necesaria para llevar una observación de tejido profundo.

Objetivos de inmersión en silicona para una observación en profundidad con alta resolución de imágenes de células vivas

El índice de refracción del aceite de silicona (ne≈1,40) es muy similar al del tejido vivo (ne≈1,38), lo que permite llevar observaciones de alta resolución en profundidad dentro del tejido vivo, minimizando la aberración esférica debida a las diferencias entre los índices de refracción. El aceite de silicona no se seca ni se endurece, por lo que no es necesario volver a rellenarlo. Esto lo hace ideal para observaciones de intervalo de tiempo prolongado.