Gli organoidi, che riproducono gli organi umani, stanno diventando sempre più importanti nello screening dei farmaci e nella modellizzazione delle malattie. Tuttavia, il loro spessore e le loro dimensioni notevoli rappresentano sfide uniche per la microscopia.

Generalmente, i ricercatori utilizzano un flusso di lavoro che alterna basso ingrandimento per la navigazione e alto ingrandimento per i dettagli oppure impiegano la tecnica dell'unione di immagini per acquisire l'intero campione. Nonostante la loro praticità, spesso gli obiettivi standard ad aria (a secco) risultano inadeguati per risoluzione e distanza di lavoro quando si acquisiscono immagini in profondità nell'organoide.

Per ottenere immagini 3D ad alta risoluzione, i microscopi confocali abbinati a obiettivi a immersione in liquido (acqua, olio o olio di silicone) rappresentano lo standard di riferimento. Tuttavia, questi approcci introducono alcune sfide operative: il contatto con l'olio può interrompersi durante il movimento del tavolino portaoggetti e l'olio residuo sulla piastra può degradare le immagini quando si torna a utilizzare obiettivi ad aria.

In questo post valutiamo una soluzione innovativa: un obiettivo a immersione in gel di silicone (LUPLAPO25XS), il primo nel suo genere, abbinato al microscopio confocale a scansione laser FLUOVIEW™ FV5000 per l'imaging di organoidi cerebrali. Analizziamo i tre principali vantaggi di questa tecnologia ottica rispetto all'uso di obiettivi convenzionali a immersione in olio di silicone.

Protocollo per l'esperimento di imaging degli organoidi

Per valutare i vantaggi dell'immersione in gel di silicone, abbiamo utilizzato l'organoide prodotto secondo il seguente protocollo:

Generazione di organoidi cerebrali
Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC; linea 201B7) sono state mantenute in condizioni indifferenziate utilizzando il mezzo eTeSR (STEMCELL Technologies). Gli organoidi cerebrali sono stati generati utilizzando il kit STEMdiff Cerebral Organoid (STEMCELL Technologies). Il processo di differenziazione, inclusa la formazione dei corpi embrioidi, l'induzione del neuroectoderma e la successiva maturazione degli organoidi, è stato eseguito secondo le istruzioni fornite con il kit STEMdiff Cerebral Organoid.

Immunocolorazione e chiarificazione dei tessuti
Gli organoidi sono stati fissati e sottoposti a immunocolorazione utilizzando DAPI per l'etichettatura nucleare, anti-TUJ1 (Alexa Fluor 488) per i marcatori neuronali e anti-PAX6 (Alexa Fluor 594) per i marcatori dei progenitori neurali. Dopo la colorazione, i campioni sono stati chiarificati utilizzando il reagente di chiarificazione tissutale Sca l eS4 prima dell'imaging.

3 vantaggi dell'immersione in gel di silicone per l'imaging degli organoidi cerebrali

L'esperimento ha dimostrato come l'obiettivo a immersione in gel di silicone LUPLAPO25XS, abbinato al microscopio confocale FV5000, abbia superato alcune sfide operative comuni dell'imaging di organoidi cerebrali. Ecco i tre vantaggi principali:

1. Stabilità dell'asse Z: eliminazione della perdita di contatto

L'immersione convenzionale in olio di silicone richiede un ponte liquido continuo tra l'obiettivo e il piatto. Durante l'imaging Z-stack profondo o regolazioni significative della messa a fuoco sull'asse Z, questo ponte può facilmente rompersi.

• La sfida dell'olio di silicone: una volta perso il contatto con l'olio di silicone, spesso il ritorno alla coordinata Z originale causa la sfocatura dell'immagine perché l'olio non riforma automaticamente un menisco perfetto. I ricercatori devono intervenire manualmente per riapplicare l'olio o regolare l'obiettivo, interrompendo l'esperimento (Figura 1).
• Il vantaggio del gel di silicone: grazie alle proprietà elastiche del gel di silicone, il contatto è resiliente. Anche se l'obiettivo viene allontanato dal piatto, quando si ritorna alla coordinata Z di destinazione viene ripristinata istantaneamente un'immagine ad alta risoluzione. Ciò consente regolazioni della messa a fuoco più flessibili e sessioni di imaging altamente riproducibili (Figura 2).

2. Cambio obiettivo ininterrotto: flusso di lavoro senza necessità di pulizia

In un tipico workflow di osservazione, spesso i ricercatori tornano a utilizzare un obiettivo ad aria a basso ingrandimento dopo un'ispezione ad alta risoluzione.

• La sfida dell'olio di silicone: L'olio di silicone lascia un residuo scomposto sul fondo della piastra per imaging. Se si passa a un obiettivo a secco senza pulire accuratamente la piastra, l'olio residuo può causare una grave aberrazione sferica, rendendo l'immagine inutilizzabile. Questo processo di pulizia richiede molto tempo e si rischia di far sobbalzare il campione (Figura 3).
• Il vantaggio del gel di silicone: Il gel di silicone non migra e non lascia residui liquidi sulla piastra. Le nostre verifiche hanno dimostrato che è possibile passare dall'obiettivo in gel a un obiettivo ad aria e riprendere immediatamente l'osservazione senza alcuna perdita di qualità dell'immagine. Ciò consente un flusso di lavoro ininterrotto che unisce la praticità degli obiettivi a secco con le prestazioni ottiche dell'imaging a immersione (Figura 4).

3. Successo dell'automazione nelle piastre multi-pozzetto: stabilità nell'unione di immagini

Spesso, la ricerca ad alta produttività richiede l'unione di immagini e l'imaging 3D di più organoidi in una piastra multi-pozzetto.

• La sfida dell'olio di silicone: In genere, lo spostamento del campione tra i pozzetti causa la separazione o l'esaurimento dell'olio di silicone, che causano errori delle analisi di imaging automatizzate. Nei nostri test, l'obiettivo in olio di silicone non è riuscito a mantenere il contatto oltre il primo pozzetto (Figura 5).
• Il vantaggio del gel di silicone: L'obiettivo a immersione in gel di silicone è riuscito ad acquisire tutti gli organoidi bersaglio in più pozzetti senza alcuna perdita di contatto (Figura 6).

Il nuovo standard per la ricerca sugli organoidi

I nostri test confermano che l'obiettivo a immersione in gel di silicone LUPLAPO25XS offre il meglio di entrambi i mondi: la facilità d'uso di un obiettivo ad aria e le prestazioni ottiche di un obiettivo a immersione.

Se combinata con il microscopio confocale a scansione laser FV5000, questa tecnologia ottica contribuisce a risolvere varie problematiche dell'imaging degli organoidi: perdita di contatto con l'olio, necessità di pulizia tra le osservazioni e interruzioni nelle acquisizioni di immagini automatizzate.

Il risultato: i ricercatori possono concentrarsi di più sugli esperimenti e di meno sull'obiettivo del microscopio.

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