应用笔记

FV3000共聚焦显微镜对经透明化处理的小鼠肝脏进行3D观察

肝脏高分辨率三维观察

由于厚组织成像随着深度增加，光的吸收和散射也会增加，因此常常使用双光子显微镜观察较厚样本的3D结构。虽然肝脏是一个典型的具有高度光散射性的组织，但采用透明化方法，以及合适的光学部件，也可以使用FV3000共聚焦显微镜对其厚组织进行3D观察。在本实验中，利用1.05数值孔径（NA）和0.8毫米工作距离（WD）的奥林巴斯30倍硅油物镜可以对经透明化处理的小鼠肝脏样品胆道树结构进行高分辨率3D观察。

实验总结

小鼠肝组织样品的透明化处理

从小鼠上采集的肝组织

通过免疫荧光染色对组织进行标记

使用SeeDB透明化处理的肝脏组织

致谢：K. Kamimoto，K.Kaneko，CY。Kok, H. Okada, A. Miyajima, and T. Itoh, "Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling," Elife, 2016 Jul. 19;5, pii: e15034, doi:10.7554/eLife.15034.

用于对复杂胆管网络进行3D可视化的实验方案。采集组织后，对胆管组织进行免疫荧光染色，以便对复杂胆管网络进行三维可视化观察。然后再用SeeDB透明化处理染色的标本¹⁾。

1）参考文献：Ke MT, S. Fujimoto, and T. Imai, "SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction," Nat Neurosci, 2013 Aug; 16 (8):1154–61, doi:10.1038/nn.3447, Epub 2013 Jun. 23, PMID:23792946

利用20倍物镜（UPLSAPO20X，NA 0.75，WD 0.6mm）对小鼠受损肝脏胆管树结构进行三维观察

该实验旨在定量测量小鼠受损肝脏胆管树结构分支的长度和厚度。为了对样品进行初步筛选，在FV3000上使用20x干镜采集200 µm厚已透明化处理的肝脏组织标本中的胆管组织（绿色，胆管上皮细胞标记物CK19）大视野连续三维图像。FV3000可以对多种样品进行有效的定量观察，并让我们能够快速找到需要进行更高分辨率观察的样品。上图中的比例尺为100 µm。

利用30x物镜（UPLSAO30XS，NA1.05，WD 0.8mm）对小鼠肝脏胆道树结构进行三维观察

对照小鼠

对照小鼠

KLF5-LKO小鼠

KLF5-LKO小鼠

https://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/appnote-movie_3d-biliary-tree-structure_view_480.mp4

视频：对照小鼠的胆道树结构

为了获得更高分辨率的三维图像，使用FV3000共聚焦显微镜和30x硅油物镜采集200 µm厚经SeeDB透明化后肝组织中胆道组织（绿色，胆道上皮细胞标记CK19）的连续三维图像（Z轴步进1 µm）。这个环节可以在保持大视场情况下以高分辨率观察对照小鼠和Klf5-LKO小鼠的胆道树结构，进而在Klf5-LKO小鼠中观察到与胆道树在空间上分离的CK19 +细胞簇（白色箭头处）。

Dr. Okada的点评：复杂胆道结构的三维可视化和精细结构分析

Dr. Hajime Okada National Institute of Genetics Mammalian Development Laboratory

Dr. Hajime Okada

在本实验中，我们分析了因节食所致的肝损伤后，与肝脏重塑相关的胆道树3D结构，并利用FV3000共聚焦显微镜对Klf5-LKO小鼠和对照小鼠的透明化肝脏组织胆道结构进行对比。FV3000的高灵敏度检测器能够以高分辨率和高亮度拍图，同时大视场图像也提高了整体采图速度，帮助我们快速获得大量可用于定量分析的图像。此外，奥林巴斯硅油物镜还能够以高分辨率进行深度成像，让我们能够发现在空间上与胆道树分离的CK19 +细胞簇。实验结果表明，各种肝损伤条件下组织重塑的胆道结构可能会受到某些分子机制的调控。

Dr. Itoh的点评：已透明化处理的肝脏的三维成像²⁾

Professor Tohru Itoh The University of Tokyo Quantitative Life Science Social Cooperation Research Department

Dr. Tohru Itoh
Project Associate Professor

迄今为止，针对肝脏的医学和生化研究主要采用以传统的组织切片2D观察代替完整器官的成像，而传统的2D成像方法难以检测和了解在各种生理条件和肝脏疾病条件下肝脏的“真实情况”。

我们研究小组针对已进行染色和透明化处理的肝脏组织开发出全新的可视化技术，首次成功实现了对小鼠完整肝脏中胆道结构的3D观察。透明化和荧光染色技术的结合让我们能够检测诸如胆道重塑等胆道结构动态变化，并对其调节机制和生理功能进行研究。在上述实验中，我们成功建立了使用SeeDB透明化方法和共聚焦显微镜对3D胆道结构进行有效可视化的实验系统。通过使用FV3000共聚焦显微镜，我们可以更好地解释胆道重塑过程中的某些分子机制。

利用本文所述的技术，FV3000可实现对肝脏中包括胆管结构在内的各种组织和细胞动态变化的3D分析。我们希望通过全新的可视化技术从组织重塑和细胞间相互作用的角度更好地了解发育和再生过程，从而推动肝脏疾病和再生医学诊断和疗法的发展。

2）参考文献：H. Okada, M. Yamada, K. Kamimoto, CY. Kok, K. Kaneko, M. Ema, A. Miyajima, and T. Itoh, "The transcription factor Klf5 is essential for intrahepatic biliary epithelial tissue remodeling after cholestatic liver injury," J Biol Chem., 2018 Apr. 27;293(17):6214-6229, doi:10.1074 / jbc。RA118.002372, Epub 2018 Mar. 9.

K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima, and T. Itoh, "Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling," Elife, 2016 Jul. 19;5, pii: e15034, doi:10.7554/eLife.15034。

K. Kaneko, K. Kamimoto, A. Miyajima, and T. Itoh, "Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis," Hepatology, 2015 Jun.;61(6):2056-66, doi:10.1002/hep.27685, Epub 2015 Apr. 22.

FV3000共聚焦显微镜如何助力我们的实验

全光谱系统实现高灵敏度检测

FV3000共聚焦显微镜采用奥林巴斯全真光谱TruSpectral检测技术，通过体相位全息透射光栅提高检测效率。与采用反射型光栅的传统光谱检测单元相比，该技术可实现更高的光通量，并将组织深部观察所需的激光功率降至最低。

硅油物镜可实现活细胞深度高分辨率观察

硅油折射率（ne≈1.40）接近于活组织的折射率（ne≈1.38），因而能够减少折射率不匹配的问题，以极小的球差对活组织内部进行高分辨率观察。硅油不会挥发，也不易变干或变硬，非常适合长时间活细胞或活组织观察。

致谢
本应用指南的编写得到以下研究人员的协助：
Division of Mammalian Development, Genetic Strains Research Center, National Institute of Genetics, Dr. Hajime Okada
Laboratory of Stem Cell Therapy, Institute for Quantitative Biosciences, The University of Tokyo, Project Associate Professor, Dr. Tohru Itoh