应用笔记
低色差物镜PLAPON60XOSC在脑组织四重免疫荧光分析中的应用
低色差物镜PLAPON60XOSC在脑组织四重免疫荧光中的应用
简介
在利用光学显微镜（如共聚焦显微镜）获取荧光图像之前使用荧光染料标记分子的方法，已成为可视化生物组织和细胞分子定位的最常用实验方法。
然而，由于显微物镜的色差所致的色差导致难以使用荧光染料精确显示紫外光和近红外区域中的细胞间共定位，因此在单个标本中很难实现多个细胞间共定位的准确可视化。奥林巴斯低色差物镜PLAPON60XOSC即使在紫外和近红外区域也能以几乎没有色差的方式准确显示荧光标记分子。下面介绍使用四种类型荧光抗体在单个标本中准确可视化荧光标记分子的共定位情况。
PLAPON60XOSC和UPLSAPO60XO的性能比较
低色差物镜的应用-脑组织的四重免疫荧光
| 脑组织的四重免疫荧光：图片（1） |
VIAAT染色（Alexa Fluor405，蓝色） CB1染色（Alexa Fluor488，绿色） VGluT3染色（Cy3，红色） DGLα染色（Alexa Fluor647，白色） |
大麻素合成酶DGLα（白色）和大麻素受体CB1（绿色）聚集在小鼠基底杏仁核的锥体细胞躯体（星号）周围，形成具有独特内陷结构的内陷突触（箭头）。这些侵入性突触表达囊泡抑制性氨基酸转运蛋白（VIAAT）（蓝色）和囊泡谷氨酸转运蛋白-3（VGluT3）（红色），表明其分别具有抑制性和兴奋性递质GABA和谷氨酰胺酸的神经化学特性。与此相比，如果未在其周围形成DGLα簇，则抑制性突触的CB1阳性、VIAAT阳性常见类型不表达VGluT3，这表明其仅具有GABA的神经化学特性。比例尺：5 μm。
| 脑组织的四重免疫荧光：图片（2） |
VIAAT染色（Alexa Fluor405，蓝色） CB1染色（Alexa Fluor488，绿色） VIP染色（Cy3，红色） DGLα染色（Alexa Fluor647，白色） |
GABAergic篮状细胞有两种表达大麻素受体CB1并控制锥体细胞躯体的亚型，一种亚型表达胆囊收缩素（CCK），另一种表达血管活性肠肽（VIP）。这种四重免疫荧光染色显示，在高表达CB1（绿色）和VIAAT（蓝色）的阳性神经末梢（红色）周围缺乏DGLα（白色），其表明VIP阳性神经末梢不参与侵入性突触的形成。比例尺：5 μm。
成像系统：
显微镜：生物共聚焦激光扫描显微镜FV1200
物镜：PLAPON60XOSC （60X, NA：1.4）
二极管激光器：405 nm，473 nm，559 nm，647 nm
图像数据由以下人士提供：
Masahiko Watanabe（医学博士）
北海道大学医学研究生院解剖学系
参考文献：
神经科学杂志2015年3月11日； 35（10）：4215-28。doi：10.1523/JNEUROSCI.4681-14.2015。
结论
如图（1）和（2）所示，针对多种功能分子和细胞标志物的四重免疫荧光可以提供有关细胞表达和亚细胞定位的详细信息，其中包括相关功能细胞与细胞间空间距离的相互依赖或独立关系。重要的是，显微镜的检测灵敏度和分辨率以及能够尽可能减小色差的物镜光学性能是实现免疫荧光目标的重要因素。
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