应用笔记

FV3000共聚焦显微镜对细胞球三维延时成像：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）48小时连续观察

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）是抗体药物作用的机制之一。诸如自然杀伤（NK）细胞和单核细胞等效应细胞可识别被抗体结合的靶细胞（如肿瘤细胞）。识别抗体后，效应细胞通过释放细胞毒性因子，诱导细胞裂解，破坏靶细胞。本应用中，我们对HT-29细胞（人结肠癌细胞）和表达功能性Fcγ受体的KHYG-1细胞（自然杀伤细胞）进行了三维共培养实验，并使用EGFR标记靶向的治疗性单克隆抗体，在FLUOVIEW FV3000共聚焦显微镜上进行48小时连续观察。由此产生的ADCC三维成像让我们成功捕获NK细胞攻击癌细胞的过程。

以更低光毒性进行3D活细胞球成像

在3D培养系统中生长的细胞球因其厚度而难以成像。最简单的应对方法是提高激发光强度，从而增加荧光亮度，然而高光照强度又不可避免地产生光毒性，对细胞造成损伤。为了解决这一难题，我们使用了奥林巴斯FV3000共聚焦显微镜。FV3000采用TruSpectral全真光谱检测技术，可以更有效地采集3D细胞球内部弱荧光信号，并降低激光的光毒性影响。此外，在深度观察时我们使用60倍硅油物镜，硅油物镜折射率更接近活细胞，比其它类型物镜更容易拍到分辨率更高信号更强的图像。因此，我们成功了捕获48小时的3D细胞球动态变化，并观察到NK细胞介导HT-29细胞死亡。

https://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/spheroid_3d_imaging_fv3000_480.mp4

图1：48小时连续观察NK细胞攻击HT-29肿瘤细胞球

将表达功能性Fcγ受体和ZsGreen荧光蛋白的NK细胞系KHYG-1（绿色）与HT-29细胞（人结肠癌细胞）肿瘤球进行共同培养。其中，HT-29细胞用抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗（Alexa Fluor 647，蓝色）标记。在连续48小时XYZT成像过程中，被杀死的肿瘤细胞因为吸收了培养液中的碘化丙啶（PI，死细胞标记物）而呈现红色。

成像条件
物镜：60倍硅油物镜（UPLSAPO60XS）
显微镜：FLUOVIEW FV3000共聚焦显微镜系统
激光：488 nm（ZsGreen，绿色），561 nm（PI，红色），640 nm（Alexa Fluor 647，蓝色）

Z轴防漂移补偿系统实现精确的延时成像

活细胞的长时间成像对于评估抗体药物有效性必不可少。为了更精确地捕获NK细胞对肿瘤细胞球的作用，我们使用Z轴防漂移补偿系统（IX3-ZDC2）来避免因外部环境变化（如温度变化）导致的焦面变化。IX3-ZDC2让我们能够在长达48小时里稳定观察3D肿瘤细胞球观察，并帮助我们鉴定NK细胞在攻击和进入肿瘤块时会主动产生形变。

图2：NK细胞系KHYG-1（绿色）在攻击和杀死以西妥昔单抗（蓝色）标记的HT-29肿瘤细胞时形态会发生变化，PI摄取（红色）代表细胞死亡。

11h

17h

22h

24h

图2：NK细胞系KHYG-1（绿色）在攻击和杀死以西妥昔单抗（蓝色）标记的HT-29肿瘤细胞时形态会发生变化，PI摄取（红色）代表细胞死亡。

FV3000共聚焦显微镜如何助力我们的实验

全光谱系统实现高灵敏检测

Loading gallery...

https://main--eds-evident-website--evident-scientific.hlx.live#wg1_inner

FV3000共聚焦显微镜采用奥林巴斯全真光谱TruSpectral检测技术，通过体相位全息透射光栅提高检测效率。与采用反射型光栅的传统光谱检测单元相比，该技术可实现更高的光通量，并将组织深部观察所需的激光功率降至最低。

利用Z轴防漂移补偿（ZDC）系统保持在焦

IX3-ZDC2 Z轴防漂移补偿系统利用光毒性最低的红外光（1级激光）识别样品焦面。采用一键式自动对焦（AF）模式可根据需要在更厚的样品中设置多个焦面，从而在多点实验中实现高效的Z-stack采集。

https://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/TruFocus_Z-Drift_Compensator_480.mp4

硅油物镜可实现活细胞深度高分辨率观察

硅油折射率（ne≈1.40）接近于活组织的折射率（ne≈1.38），因而能够减少折射率不配的问题，以极小的球差对细胞球或活组织内部进行高分辨率观察。硅油不会挥发，也不易变干或变硬，非常适合活细胞和活组织长时间观察。

https://adobeassets.evidentscientific.com/content/dam/video/video/library/Silicone_Objectives_withVO(4)_480.mp4

Dr. Yuji Mishima的点评

Dr. Yuji Mishima

近年来，肿瘤研究中对荧光成像的需求不断增长，特别是3D肿瘤球在临床前药物筛选的应用，可以更直观地检验和评估抗体药物药效。3D细胞球因为厚度的缘故，使用荧光方法也很难观察其内部信息。得益于FV3000共聚焦显微镜，我们能够对3D肿瘤细胞球进行完整的48小时观察。在整个ADCC实验过程中，我们能够准确测量活肿瘤细胞、死细胞和效应细胞（NK细胞）对抗体治疗的反应。我认为FV3000共聚焦系统对于评估抗体药物的治疗效果非常有效。

致谢
本应用指南的编写得到以下研究人员的协助：
The Cancer Chemotherapy Center of JFCR, Dr. Yuji Mishima