Macro to Micro 共焦点イメージングの壁を超える

1本の対物レンズで広視野・高解像度・深部観察を実現

現代の生命科学研究、特に神経生物学や発生生物学などにおいては、細胞内の構造や機能を、その細胞が本来存在していた組織の構造や機能と関連づけて解析することが強く求められている。

共焦点レーザー走査型顕微鏡やスピニングディスク共焦点顕微鏡は、高解像度蛍光イメージングの主要な手法である。しかし、厚いサンプルをマクロからミクロまでの包括的なイメージングを行うには、対物レンズの限られた作動距離や、標本と浸液の屈折率のミスマッチに起因する収差、低倍対物レンズと高倍対物レンズの煩雑な交換といった課題を克服する必要があった。
本ホワイトペーパーは、広視野、長作動距離、高開口数（NA）を１本の対物レンズで実現し、さらに深度に応じた自動球面収差補正を組み合わせることで、これらの課題を解決し、Macro to Micro イメージングを効率化するソリューションの詳細を示す。

共焦点レーザー走査型顕微鏡によるMacro to Micro イメージングの課題

従来の60倍などの高倍率・高NA油浸対物レンズを用いた共焦点イメージングでは、細胞レベルの詳細な情報は取得できたものの、厚みのある組織全体の構造との関連付けが困難であった。そのため、まず低倍率対物レンズで組織の全体像を撮影し、続いて高倍率油浸対物レンズへ切り替えて局所領域を高精細にイメージングする必要があった。しかし、この方法はドライ対物レンズと油浸対物レンズを切り替える煩雑さに加え、位置ずれのリスクも伴うという問題があった。

この課題を解決するには、広視野、長作動距離、高NAの三要素を同時に満たし、一本の対物レンズでマクロからミクロまでイメージングできることが求められていた。しかし従来、このような性能を備えた対物レンズは、同焦点距離75mmの特殊な対物レンズに限定され、専用の顕微鏡でのみ使用可能であり、一般的な倒立顕微鏡では使用ができなかった。さらに、各種組織透明化試薬の屈折率(表 1)は1.38~1.56に分布していて、透明化処理によって屈折率の高くなった標本に対応するのが困難であった点も、深部観察の大きな要因となっていた。

組織透明化試薬

屈折率

BABB

1.56

RapiClear

1.47、1.49、1.52、1.55

SeeDB2S

1.52

CUBIC-R+

1.52

SCALEVIEW–S4

1.47

SeeDB2G

1.46

Focus Clear

1.45

SCALEVIEW–A2

1.38

^{表 1} ^{代表的な組織透明化試薬の屈折率}

新油浸対物レンズ LUPLAPO25XOの開発

Evidentは、高性能 X Line^TM対物レンズで培った極薄レンズ研磨技術（参考 1）を応用し、世界で初めて同焦点距離45mmのコンパクトサイズで汎用的に使用できるアポクロマート対物レンズにおいて、NA1.0、作動距離1.0mmを両立した油浸対物レンズLUPLAPO25XOを開発した。倍率は25倍という中倍率であるため、従来よりも、より広く、より深く、より高精細なイメージングが可能となる（図1、表2）。さらに、標本の屈折率1.45～1.56に対応する補正環を搭載し、さまざまな透明化試薬においても、球面収差を効果的に抑制することができる（図 2）。さらに、FLUOVIEW^TM FV5000にはTruResolution^TMシステムによる自動補正環調整機能が搭載されており、ユーザーは誰でも簡単に球面収差を補正できる。また、Zスタック画像撮影時にはZ深度に応じて常に最適な補正環位置に自動調整することにより、三次元データ全体を通して球面収差が補正された高品質な画像を取得することが可能である（参考２）。これらの技術的進展により、組織全体の構造と細胞レベルの微細構造を、一本の対物レンズで高精度に同時観察できるようになった。

LUPLAPO25XO objective lens.

^{図 1} ^{LUPLAPO25XO 対物レンズ}

仕様

倍率

25倍

1.0

作動距離

1 mm

浸液

オイル

補正環

温度23℃～37℃
標本屈折率 1.45～ 1.56

^{表 2}^{LUPLAPO25XOの仕様}

^{図 2 深部観察向け対物レンズ(3種)の標本屈折率対応範囲と深部観察範囲}
^{このグラフは、補正環の調節によって球面収差を抑制できる標本の屈折率範囲と、到達可能なイメージング深度を示している。}

^{LUPLAPO25XOの場合、補正環を調整することにより、屈折率1.45～1.56の標本であれば深さ1 mmまで球面収差を補正することが可能であり、代表的な組織透明化試薬で処理された標本を深さ1 mmの領域を補正した状態で高精細にイメージングすることができる。また、この屈折率範囲より低い標本の場合であっても、補正環により一定の深さまで収差補正が可能である。例えば生細胞（屈折率約1.36～1.38）や、SCALEVIEW-A2（屈折率　1.38）で透明化処理された組織標本の場合でも、深さ約500 µmまで、比較的良好な画像を取得することができる。}

生命科学研究分野のアプリケーション

LUPLAPO25XO対物レンズは、組織透明化標本の深部観察や細胞微細構造と組織構造の同時可視化に最適である。特にFLUOVIEW FV5000を用いた共焦点三次元イメージングにおいて、その性能を最大限に発揮する。

広視野高解像3D画像の取得

LUPLAPO25XO対物レンズを使用することで、約230nmの分解能で、約0.5mm四方という広いエリアの画像を一度のスキャンで取得することができる。ここに示す画像は、組織透明化試薬SeeDB2(n=1.52)で透明化されたマウス脳スライスを表面から深さ250　µmまで取得したZスタック画像を最大強度投影（MIP）で表示したものである（図 3）。従来、この広さを同等の分解能で撮影するためには、60倍の油浸対物レンズを用いて3×3の9エリアを個別に撮影し、それらを貼り合わせる必要があった。また、60倍油浸対物レンズの作動距離は約0.1 mmと短いため、250µmの深さまでの撮影は不可能であった。LUPLAPO25XOは広視野と長作動距離を兼ね備えているため、深部観察を効率的に行うことができる。これにより、広いエリアの詳細な三次元画像を短時間で取得でき、従来の方法に比べて作業効率が飛躍的に向上する。

Mouse brain slice captured on the FLUOVIEW FV5000 confocal laser scanning microscope.

^{図 3}^{FLUOVIEW FV5000で撮影した}^{in utero} ^{エレクトロポレーションによって7色Tetbowを発現させ、SeeDB2で透明化したマウス脳スライスの画像}
^{標本作製、画像の取得・提供にご協力賜りました先生：}

^{九州大学大学院医学研究院　藤本聡志先生、今井猛先生}

超高密度画素数での細胞内微細構造のイメージング

さらに、8192×8192のピクセル数で最大視野範囲を撮影すると、ピクセルピッチ69nmで画像取得が可能である。この画像データにTruSightデコンボリューション処理を適用することで、従来は超解像顕微鏡を用いなければ可視化が困難であった微細構造まで明瞭に観察することが可能となる。その結果、組織構造と細胞の微細構造を一枚の画像の中で連続的かつ包括的に観察することが可能になった（図 4）。

^{図 4}^{FLUOVIEW FV5000で撮影した}^{in utero}^{エレクトロポレーションによって第2/3層の錐体細胞にYPetを発現させ、SeeDB2で透明化したマウス脳スライスの画像}
^{左図：　8192x8192ピクセルで取得したZスタック画像をTruSight デコンボリューション処理を施し、最大強度投影（MIP）表示したもの}

^{右図：　左図の点線で囲まれた領域の拡大図}
^{標本作製、画像の取得・提供にご協力賜りました先生：}

^{九州大学大学院医学研究院　藤本聡志先生、今井猛先生}

広範囲の高精細画像の取得

さらに、隣接する視野を連続して撮影し、それらを貼り合わせることで、より広範囲の高解像度画像を取得することが可能である。この手法を用いることで、マウス胚の全体の構造を高精細に撮影することも可能である（図５）。

図 5 FLUOVIEW FV5000で撮影したマウス胚のホールマウント免疫蛍光画像。
Endomucin （緑）で血管が可視化され、Palloidin （赤）でラベルされたF-actinが細胞形態を示す。　CED＋を用いて透明化されたサンプルの深さ700umの3次元共焦点画像をXY方向に170箇所撮影して貼り合わせ処理を施した。

Courtesy of Dr Emma Siragher, Hanna group, Loke Centre for Trophoblast Research, Department of Physiology, Development and Neuroscience, Univ. of Cambridge

まとめ

広視野・長作動距離・高NAの特性を備えた対物レンズLUPLAPO25XOを、FLUOVIEW FV5000に搭載することで、約0.5 mm四方の広い領域を約230 nmの分解能で一括取得することができる。さらに、標本の屈折率1.45～1.56に応じた自動球面収差補正を行いながら、最大1 mmの深さにわたる三次元画像取得が可能である。

加えて、8192×8192ピクセルで最大視野を撮影した場合にはピクセルピッチ69 nmとなり、これに、TruSightによるデコンボリューション処理を組み合わせることで、従来は超解像顕微鏡を用いなければ可視化が困難であった微細構造まで明瞭に描出できる。また、隣接視野の連続撮影と画像貼り合わせ処理により、さらに広範囲の高解像度画像を取得することも可能である。

これらの総合的な性能により、発生生物学や神経科学などの分野で求められる個体や組織のマクロ構造と細胞レベルのミクロの微細構造を、同一データセット内で統合的に解析可能なイメージングシステムが実現した。

著者

株式会社エビデント　光学開発　対物レンズ開発　小林　直史

株式会社エビデント　プロダクトマネージメント　宇都宮　弘美

参考

1. Israel, K. 2020. 技術的な壁を打開し、Edison Award（エジソン賞）を受賞したX Line対物レンズ | オリンパスライフサイエンス

2. Utsunomiya, H. 2026.　TruResolution Objectives Maximize Resolution in Deep Imaging | Olympus LS

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